植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及GFP表达

[目的]研究了植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及用pClYVV／CP／W表达绿色荧光蛋白（GFP），为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pCIYVV基因组的NIb／CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头，构建pCIYVV／CP／W载体，并将绿色荧光蛋白基因插入pCIYVV／CP／W中构建pCIYVV／CP／W／GFP载体，用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测，并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pCIYVV／CP／W／GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型CIYVV相同的症状，发病率达100％，表明重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP．有侵染性，外源基因的插入没有破坏载体pCIYVV／CP／W的开放阅读框；以感染叶总RNA为模板，对pCIYVV／CP／W／GFP表达GFP外源基因的稳定性进行了检测，从F0（重组病毒质粒最初转录出的病毒）一直检测到Fd子代病毒。检测结果表明，外源基因在L子代病毒基因组中稳定存在；以从感染叶中提取的总蛋白为抗原，以GFP抗体为第1抗体，以碱性磷酸酶标记抗体为第2抗体，用Western杂交对重组病毒克隆pCVYVV／CP／W／GFP表达外源蛋白进行了定性检测。从F0一直检测到F4子代病毒。检测结果表明，重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP至少到F4子代病毒能稳定表达GFP。     

植物病毒载体介导的sMMO-C在蚕豆植物中的表达

构建了可溶性甲烷单加氧酶C亚单位(soluble methane monoxygenase-C component,sMMO-C)基因和绿色荧光蛋白-S65T(green fluorescence protein,GFP-S65T)基因的融合基因sMMO-C/GFP-S65T.将融合基因sMMO-C/GFP-S65T克隆到三叶草黄脉病毒 (glover yellow vein virus,ClYVV)侵染性植物表达载体pClYVV/CP/W的NIb/CP基因之间,构建了侵染性霞组病毒克隆pCV-mmoC/GFP-S65T.RT-PCR检测结果表明,sMMO-C/GFP-S65T在子代病毒基因组中获得了转录.用GFP抗体进行蛋白质杂交(western blotting,WB),检测到25kDa左右的GFP蛋白,这一结果表明GFP蛋白在被pCV-mmoC/GFP-S65T侵染的寄主植物中获得了表达,并被病毒自身编码的Nla蛋白酶从病毒聚合蛋白及sMMO-C/GFP-S65T融合蛋白中自动切断.可见,sMMO-C亚单位蛋白在植物中获得了表达,因在sMMO-C/GFP-S65T中sMMO-C位于GFP上游.     

用植物病毒载体表达小球状病毒抗原蛋白的研究

将引起人类腹泻主要病原物小球状病毒(Small round structured virus;SRSV)编码抗原蛋白基因的全长序列1605bp,导入来自三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组的NIb/CP基因之间,构建了重组病毒克隆pClYVV-NV1.6。用上述重组病毒克隆接种蚕豆植物,表现了与野生型ClYVV相同的症状。从发病叶中提取总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)对上述重组病毒克隆的转录进行了检测,结果表明,外源基因在F4子代病毒基因组中仍然稳定存在。从发病叶中提取总蛋白,用酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)及蛋白质杂交(Western blotting;WB)对上述重组病毒克隆表达的目的基因产物抗原蛋白进行了测定,结果表明,重组病毒克隆pClYVV-NV1.6之目的基因产物的表达量随寄主植物发病后时间的推移而变化,最大表达是在寄主植物发病后第9天,最大表达量为每克鲜叶可表达160.00μg,这一研究结果为用植物生产抗SRSV口服疫苗提供了有力的基础。     

植物病毒载体介导的可溶性甲烷单加氧酶B亚单位在蚕豆植物中的表达

用基因操作技术将编码可溶性甲烷单加氧酶B亚单位（Soluble Methane Monoxygermse-B component：SMMO-B）的基因全长序列导入来自三叶草黄脉病毒（Clover yellow vein virus；CIYVV）侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W基因组的NIb／CP基因之间，构建了重组病毒克隆pCV—mmoB。用上述重组病毒克隆接种该病毒的自然寄主植物蚕豆，表现了与野生型CIYVV相同的症状。RT—PCR检测结果表明，子代病毒基因组中的外源基因获得了转录。蛋白质杂交（Western blotting；WB）检测结果表明，sMMO—B亚单位蛋白在被重组病毒克隆侵染的寄主植物中获得了表达。     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。     

一个表达GFP蛋白的FoMV病毒表达载体（英文）

【目的】由可侵染单子叶植物和双子叶植物的病毒Foxtail mosaic virus (FoMV)构建病毒表达载体。【方法】通过在病毒3’端非编码区插入Potato virus X (PVX)病毒的启动子PVXprom和外源基因序列构建病毒表达载体。【结果】构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP,该载体能在本氏烟接种叶中表达GFP绿色荧光蛋白。【结论】成功构建了重组病毒表达载体pCB301-FoMV-CP-PVXprom-GFP。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建(英文)

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY17基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了Os-WRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBin-GFP/OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

伪狂犬病毒PK/gG/GFP重组转移载体的构建和表达

在构建了含伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)湖北株部分PK基因和gG基因转移载体的基础上，利用平端连接的方法将绿色荧光蛋白(GFP)的基因表达盒插入到缺失的部分，并在下游引入了1个多克隆位点，构建了重组转移载体KGDF。用限制性内切酶鉴定重组转移载体KGDF。根据质粒EGFP-C1中的GFP基因序列设计1对引物鉴定GFP表达盒插入的正确性。用脂质体转染试剂盒将KGDF和PRVFIB的基因组或病毒共转染BHK-21细胞，在荧光显微镜下将出现病变的荧光斑挑出得到重组病毒。将重组病毒扩大培养后提取基因组鉴定重组病毒中的GFP基因，并通过挑取病变的荧光斑的方法纯化重组病毒。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

CP4-EPSPS蛋白在大肠杆菌中的表达与制备

构建了一个含有CP4-EPSPS外源基因的细菌表达载体并在大肠杆菌Transtta菌株中的高效表达,通过SDS-PAGE检测发现,目标蛋白完全以可溶性方式存在于细胞破碎上清液中,且约占到细菌可溶性蛋白的40%左右。收集该上清液并进而通过连续2次镍柱亲和层析,CP4-EPSPS重组蛋白纯度可达99.9%以上,对其进行N端序列分析,与预期的结果完全一致。以其作为标准品,通过ELISA,成功检测出三株CP4-EPSPS转基因烟草中目标蛋白含量分别为0.292 μg/g、0.477 μg/g和0.703 μg/g。该蛋白表达和纯化体系可为CP4-EPSPS转基因植物蛋白量值溯源传递的标准物质研制提供稳定物质基础。     

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。     

应用cre/lox植物表达载体的AtNHX1基因转化杨树研究

[目的]研究Na^＋／H^＋逆向转运蛋白AtNHXl基因对杨树的转化。[方法]以杨树南林895杨的叶片作为外植体，采用根癌农杆菌介导法，构建cre／lox植物表达载体，并对3株转基因植株进行PCR分子检测。[结果]结果表明，较适合的转化条件为：外植体在分化培养基上经过2d预培养后于0D600nm值为0．3～0．4的菌液中浸泡7min，卡那抗性绿苗率可达43．9％；PCR分子检测表明，目的基因已经整合到杨树基因组中。[结论]该系统可以应用于杨树的基因工程研究。     

联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。     

转CP基因线辣椒对CMV的抗病性组分研究

以转化 CMV外壳蛋白基因 ( CP基因 )的线辣椒 ( Capsicum annuum var. longunt)为试材 ,系统研究了 CP基因介导抗病性的组分和表达特点。摩擦接种黄瓜花叶病毒 ( CMV,浓度 2 0μg/ ml)后 ,转基因线辣椒显症延迟 4～ 1 0 d,显症率和严重度大幅减低 ,仅部分植株表现轻度花叶。接种叶片上 CMV侵入位点数目比未转化对照品种减少 6 7.0 %～ 86 .4 %。接种后第 9天 ,转基因株系接种叶中 CMV含量仅为未转化对照的32 .4 %～ 37.3%。病毒由接种叶向邻叶转出始期 ,比未转化对照晚 9～ 1 5h。接种后 3d,转基因株系 1 6— 1 3的未接种叶中未能检出 CMV,而同期未转化对照已有 4片邻叶检出了 CMV。接种后 6 d,1 6— 1 3仅上下位相邻叶检出了 CMV,此时对照已全株带毒。转基因株系接种后 6 d,整株 CMV含量为未转化对照的 4 2 .5%。这表明线辣椒 CP基因介导的抗病性是多组分的 ,包括对病毒的抗侵入、抗扩展和抗增殖