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相似文献
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1.
【目的】建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)TaqMan实时荧光定量(RT-qPCR)检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法。【方法】参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5′端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD 18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线。在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品(粪便样品39份,肠道样品44份)进行检测。【结果】建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×101拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份(22份粪便样品,9份肠道样品)检出率为37.3%(31/83),显著高于普通PCR检测结果(检出率12.0%(10/83))。【结论】建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好。  相似文献   

2.
【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鳜鱼蛙病毒(Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV)和鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)的三重PCR检测方法,为鳜鱼等养殖品种流行病学调查提供方法支撑。【方法】根据ISKNV MCP基因、SCRIV MCP基因和SCRV N基因设计3对特异性引物,对PCR扩增反应中的退火温度和引物用量进行优化,建立可同时检测 ISKNV、SCRIV和SCRV的三重PCR方法。为验证该方法的敏感性和特异性(备测病毒为IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV和SVCV),对22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一和三重PCR检测。【结果】成功建立了三重PCR检测方法,利用该方法可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV,特异性较好,对IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV等无扩增;该方法敏感性好,对3种病毒核酸的检测下限均为0.01 ng/μL;利用该方法和3种病毒单一PCR方法同时对22份临床样品进行检测,结果显示2种方法吻合率为100%,其中ISKNV阳性率为27%、SCRIV 阳性率为41%、SCRV阳性率为9%、ISKNV和SCRIV混合感染阳性率均为9%,无ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染。【结论】建立的三重PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点,可对这3种病毒进行快速鉴别诊断。  相似文献   

3.
对陕西省某羊场莎能奶山羊的球虫感染情况进行调查研究,应用球虫卵囊富集技术,结合形态学方法对采自该场2~12月龄的49份(≤2月龄22份;3~5月龄13份;6~12月龄14份)奶山羊新鲜粪便样品进行球虫卵囊分离,显微镜检测和OPG(Oocysts per gram)统计。结果显示,莎能奶山羊球虫总感染率为98.0%(48/49),OPG统计发现,3~5月龄羔羊球虫平均OPG最高,为2 442个/g。最高OPG存在于2月龄羔羊样品中,为15 083个/g,且该羊只出现严重腹泻症状。对富集分离到的球虫卵囊进行孢子化和种类鉴定,共鉴定出7种山羊艾美耳球虫。进一步对随机提取的277个孢子化球虫卵囊进行优势虫种统计分析,其中雅氏艾美耳球虫(Eimeiria ninakohlyakimovae)、阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)和柯氏艾美耳球虫(E.christenseni)占比最高,依次为17.3%(48/277)、15.9%(44/277)和15.2%(42/277),是该羊场莎能奶山羊球虫的优势虫种。综上所述,初步明确该羊场莎能奶山羊不仅普遍存在球虫感染,而且存在多种球虫混合感染和致病力较强的优势虫种。  相似文献   

4.
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg2+终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID50/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。  相似文献   

5.
为探索慢性应激与圈养林麝球虫感染之间的相关性,采用饱和盐水漂浮法对四川九药林麝繁育中心采集的粪便样本中的寄生虫卵进行检测,用麦克马斯特计数法对虫卵进行计数,应用酶联免疫吸附法测定粪便皮质醇代谢水平,并基于广义线性模型分析年龄、参配对粪便皮质醇代谢水平的影响,以及年龄、参配及粪便皮质醇代谢水平与球虫感染强度之间的关系。结果表明:年龄和参配的交互作用对粪便皮质醇代谢水平影响显著,3岁龄参配个体粪便皮质醇代谢水平显著低于6岁龄参配个体,其余3组间差异不显著。宿主年龄和参配对球虫感染强度无影响,但粪便皮质醇代谢水平对球虫感染强度影响极显著(GLMs, P < 0.01)。粪便皮质醇代谢水平和球虫感染强度呈极显著负相关(R = - 0.502, P < 0.01),3个浓度组之间球虫感染强度差异极显著(P < 0.01)。慢性应激会增加林麝寄生虫易感性,应激强度与寄生虫感染强度呈显著正相关关系。建议麝场不要选取3岁龄个体作为种麝,并减少人为刺激或扩大每个林麝个体的活动空间来降低林麝的应激反应,加强林麝的健康管护。  相似文献   

6.
基于荧光显色的IBV LAMP检测方法研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】建立基于荧光显色的可视化禽传染性支气管炎病毒(IBV)环介导等温扩增(LAMP)检测体系,为IBV的快速临床检测提供有力的技术支持。【方法】根据NCBI中收录的IBV 5a+5b基因的8个区域设计了3对LAMP引物,通过对反应体系各组分和条件的优化,建立IBV LAMP检测方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。分别用SYBR Green I和一定浓度比的钙黄绿素/锰离子混合物作为显色剂,对IBV LAMP检测结果进行可视化判定。应用该检测体系和PCR方法对临床送检的60份样品同时进行检测,比较2种方法的阳性检出率。【结果】成功建立了IBV LAMP检测方法,该方法能够在等温(63 ℃)条件下1 h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低可以检出1拷贝/μL的阳性重组质粒,比普通PCR方法敏感100倍,而对其他病毒检测结果均为阴性。应用SYBR Green I和钙黄绿素/锰离子显色时,阴阳性样品均有强烈的颜色对比,其中0.05 mmol/L钙黄绿素与0.6 mmol/L锰离子混合液可以用于LAMP扩增产物的判断,其结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。在对60份临床样本的检测中,LAMP和PCR方法检测出的阳性样本数量分别为49份和42份。【结论】建立了基于荧光显色的IBV LAMP检测方法,该方法具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。  相似文献   

7.
【目的】明确陕西省主要水稻种质资源中香味基因的存在状况,为香型水稻育种提供依据。【方法】利用针对香味基因fgr开发的四引物扩增受阻突变体系PCR技术,对陕西省164份水稻种质资源的香味基因fgr进行检测。【结果】在164份供试水稻材料中,127份为非香材料,2份为香型纯合体,35份为杂合体。【结论】本试验检测结果真实可靠,所用四引物扩增变阻突变体系PCR可以作为香型水稻检测认定的有效方法;陕西省水稻种质资源中香味基因占有一定比例。  相似文献   

8.
为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)和 4 型(PCV4)的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,根据 GenBank 已登录的 PCV3 和 PCV4 基因保守序列设计特异性引物和 TaqMan 探针,经优化各反应条件,构建标准曲线,分析其敏感性、特异性和重复性,并利用建立的荧光定量 PCR 方法对采自安徽省的临床样品进行检测,与普通 PCR 方法进行一致性评价。结果显示,PCV3的标准曲线为Y=-3.534 6 logX+41.11(R2=1.00),PCV4的标准曲线为Y=-3.382 5 logX+40.67(R2=1.00)。PCV3 和PCV4 的检测限分别为49.5 和27.1 copies·μL -1。对猪圆环病毒1型(PCV1)和 2 型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无特异性扩增,组内和组间变异系数均<1%。临床样品检测结果显示, PCV3阳性检出率为 40.8%,PCV4 阳性检出率为 20.4%,混合感染率为 19.0%。建立了灵敏、特异,可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。  相似文献   

9.
为明确陕西省主要水稻种质资源中抗稻瘟病基因Pi ta的存在状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。利用在抗稻瘟病基因Pi ta区域设计的四引物扩增受阻突变体系PCR方法,对陕西省2010-2012年水稻区域试验的327份材料进行Pi ta基因位点检测。结果表明,4份材料为抗性基因纯合体,40份材料为抗性基因杂合体,276份材料在Pi ta位点为感性基因纯合体,7份材料未检出条带。检测结果真实可靠,可以作为检测水稻Pi ta基因位点的有效方法。  相似文献   

10.
旨在确定新疆地区致犊牛腹泻病中埃希氏大肠杆菌的基因型。从采自阿克苏周边的3个奶牛场30份患腹泻的犊牛粪便中分离、纯化、鉴定出34株埃希氏大肠杆菌。根据GenBank公布的大肠杆菌的eaeA基因序列,用Oligo 6.0软件分别设计2对特异性引物,利用聚合酶链式反应,对所分离大肠杆菌eaeA基因进行PCR扩增。结果表明,有4株PCR 产物为918 bp的目的片段,阳性率为11.8%(4/34)。将阳性样品进行序列分析,结果与已发表的序列同源率为100%。所测序列呈递GenBank数据库,得到序列登陆号为JQ350701、JQ350702、JQ350703和JQ350704。  相似文献   

11.
为了解新疆乌鲁木齐市宠物源葡萄球菌对临床常用抗菌药物的耐药情况及携带耐药基因的情况,采用琼脂稀释法对乌鲁木齐市某宠物医院分离鉴定的154株宠物源葡萄球菌进行临床常用10种抗菌药物耐药性检测,并用PCR方法检测葡萄球菌9种耐药基因:喹诺酮类(norA)、大环内酯-林可胺类(ermB)、四环素类(tetA、tetM)、β-内酰胺类(mecA、femA)和氟苯尼考类(cfr、fexA和fexB)。耐药性检查结果表明葡萄球菌对苯唑西林、四环素、左氧氟沙星和氟苯尼考的耐药率在50%以上,宠物源葡萄球菌多重耐药集中在4~5类,且耐药谱型多样化。基因检测结果显示fexA(31.2%)基因的检出率最高,其次是ermB(26.7%),未检出cfr、fexB和tetA基因。新疆乌鲁木齐市宠物源葡萄球菌普遍存在耐药和多重耐药情况,其中氟苯尼考耐药基因fexA检出率最高,揭示宠物源葡萄球菌耐药情况严重,应根据药敏试验及基因检测结果,合理选用抗菌药物,并加强对耐药菌的监测。  相似文献   

12.
【目的】了解广州市宠物源大肠埃希菌Escherichia coli耐药性和耐药基因携带情况。【方法】2016年7月至2017年7月从广州市4家宠物医院采集健康或患病犬猫样品共319份,其中,健康动物127份,患病动物192份。采用选择性培养基分离大肠埃希菌,利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定菌种;采用琼脂稀释法测定大肠埃希菌对11种抗菌药物的敏感性,利用PCR和测序检测耐药基因的携带情况。【结果】319份样品共分离得到大肠埃希菌203株,其中,患病动物源109株,健康动物源94株。203株大肠埃希菌中有179株至少对1种抗生素耐药;对氨苄西林耐药率最高(76.85%),对头孢噻肟、四环素、多西环素和磺胺甲噁唑-甲氧苄啶耐药率均高于50%;对阿米卡星最为敏感,耐药率仅为10.84%。患病动物源大肠埃希菌对11种抗菌药物的耐药率均高于健康动物源,除阿米卡星、氟苯尼考和磷霉素外,对其他药物的耐药性均差异极显著(P 0. 01)。耐药基因检测结果显示,floR检出率最高(检出率为34.97%),blaCTX-M-9G、blaCTX-M-1G、fos A3、rmt B和bla CMY-2检出率分别为22.66%、20.19%、17.73%、10.34%和1.48%,未检测到blaCTX-M-2G和blaCTX-M-25G。【结论】广州地区宠物源大肠埃希菌耐药状况严峻,且常携带多种重要耐药基因。应当加强对宠物源细菌耐药性的监测。  相似文献   

13.
为建立特异的化脓隐秘杆菌PCR检测方法,基于化脓隐秘杆菌PLO基因设计4对引物,对12种细菌进行常规PCR扩增,以评价方法的特异性,并运用建立的PCR方法检测临床样本。结果显示只有使用F1/R1引物对的PCR方法能鉴别化脓隐秘杆菌,并能用于临床样本检测。  相似文献   

14.
上海地区宠物犬中戊型肝炎病毒流行病学调查   总被引:4,自引:0,他引:4  
[目的]为探讨宠物犬在戊型肝炎病毒(HEV)流行环节中的作用提供依据。[方法]以散养宠物犬为研究对象,从上海地区及其周边地区随机采集70份血清样品,通过双抗原夹心ELISA试验检测抗HEV抗体,分析不同品种和不同性别宠物犬中血清抗HEV抗体阳性率。利用反转录巢式PCR检测血清中病毒核酸。[结果]在70份宠物犬血清样品中,15份样品中抗HEV抗体呈阳性,阳性率为21.4%。上海地区宠物犬阳性率为27.5%,高于上海周边地区。在供试的宠物犬品种中,杜宾犬的HEV抗体阳性率较高(33.3%),其他品种宠物犬为11.1%~25.0%。雌性宠物犬中HEV阳性率为34.4%,显著高于雄性宠物犬。在各种宠物犬中未检测到HEV核酸颗粒。[结论]宠物犬对HEV敏感,在HE流行环节中具有不容忽视的作用。  相似文献   

15.
白斑综合征已给安徽省克氏原螯虾产业带来了巨大的经济损失。为了解安徽省白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)分子流行病学,2016年4—8月在安徽省6个市采集9个养殖的克氏原螯虾样本进行WSSV套式PCR检测,扩增病毒可变区ORF94、ORF75和ORF125,将获得序列进行比较分析。结果显示,9个样本均在第1轮PCR扩增中获得阳性结果,其ORF94的重复单元(repeat unit,RU)数量为2、4、7、8和12,2RUs为常见基因型,ORF75的组合RUs总数为3、6、9、10和11,9 RUs为常见基因型,排列顺序为45、102、45、102、3×45、102和45,ORF125的RUs为5~9,其中7 RUs和6 RUs为常见基因型。  相似文献   

16.
采集安徽马鞍山水稻条纹叶枯病感病稻株,TRIzol法提取样本总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,获得水稻条纹病毒(RSV)安徽分离物的RNA3部分片段,克隆并测序。序列分析表明,该片段全长874 nts,含有完整的NS3基因,NS3基因序列长度为636 nts,编码211个氨基酸。序列比对发现,RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市RSV分离物NS3基因间的序列相似性高达97.6%~99.4%,而与RSV云南分离物NS3基因间的序列相似性相对较低,为93.4%~95.4%。构建RSV NS3基因系统关系树,发现RSV安徽分离物NS3基因与来源于华东各省市8个RSV分离物NS3基因聚成一个单独的分支,说明华东各省市各个RSV分离物亲缘关系最近。将RSV安徽分离物NS3基因插入植物表达载体pBIN438,构建重组植物表达载体pBIN-NS3并转化农杆菌。将含pBIN-NS3的农杆菌和含pBIN-GFP的农杆菌共浸润16c本氏烟叶片,6天后紫外灯下观察发现,共浸润区表现出强烈的绿色荧光,说明16c本氏烟GFP基因局部沉默被抑制,可以初步证明RSV安徽分离物编码的NS3蛋白是一个RNA沉默抑制子。  相似文献   

17.
为了揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)安徽分离物分子变异及系统进化情况,从安徽省5个地区采集感染CGMMV的葫芦科样本。提取感病样本总RNA,经RT-PCR扩增、克隆和测序,获得17个CGMMV分离物的cp基因序列。序列比对发现,17个CGMMV安徽分离物的cp基因核苷酸序列相似性极高,达98.4%~100%,与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物cp基因核苷酸序列相似性也非常高,达98.6%~100%,而与CGMMV西班牙分离物和俄罗斯分离物cp基因核苷酸序列相似性相对较低,为90.7%~92.6%。从构建的系统关系树可以看出,17个CGMMV安徽分离物与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物形成1个单独的分支,而CGMMV俄罗斯与西班牙分离物聚成另1个分支,说明来源于中国和东亚的CGMMV亲缘关系较近。  相似文献   

18.
2015—2017年新疆动物源鼠伤寒沙门菌耐药性分析   总被引:1,自引:1,他引:0  
为完善新疆动物源鼠伤寒沙门菌耐药的相关数据,为多重耐药病源菌的防控提供依据,本研究检测了2015—2017年新疆不同动物源鼠伤寒沙门菌的流行情况、耐药特性及耐药基因携带率。对经选择性培养基和特异性PCR鉴定的不同动物源鼠伤寒沙门菌,通过琼脂稀释法进行环丙沙星等12种抗菌药物的最小抑菌浓度测定,同时采用PCR方法测定耐药基因在鼠伤寒沙门菌中的携带情况。结果表明:从不同动物中共分离获得162株鼠伤寒沙门菌,分离率由高到低依次为宠物(犬和猫)、猪、羊、牛和鸡;药敏试验显示,不同动物源鼠伤寒沙门菌对环丙沙星、氨苄西林、四环素和氟苯尼考的耐药率80.0%,未检出对阿米卡星和磷霉素耐药的耐药菌株。从不同动物源分离的162株鼠伤寒沙门菌中有159株菌为多重耐药菌株,占98.1%;不同动物源鼠伤寒沙门菌多重耐药均以CIP-AMP-TET-FFC-SMZ 5耐谱型为主。经耐药基因分析,不同动物源鼠伤寒沙门菌耐药基因检出率为6.8%~97.4%,未检出blaSHV、qnrD、rmtB和mcr-1基因。综上,鼠伤寒沙门菌在新疆不同动物中流行率高,耐药现象严重,多重耐药菌株较多且耐药基因携带率高,部分不同动物源菌株间具有相同的耐药表型和耐药基因型。应加强畜牧业抗菌药物使用的管理制度,进而控制鼠伤寒沙门菌耐药性的发展趋势。  相似文献   

19.
为了评价无患子外种皮提取物(以下称无患子提取物)及其与除草剂复配制剂的田间实际除草效果,作者在安徽省桐城市黄甲镇农田开展了无患子提取物及其与甲草胺、噁草酮的4种复配制剂防除玉米田杂草的田间药效试验。结果表明,供试药剂对玉米田主要杂草具有良好的防除效果。在3900~4500 mL·hm-2的用量范围内,施药后15 d和30 d,30%无患子提取物水剂对马唐、莎草的株防效分别达82%和87%以上,鲜重防效都达85%以上;对丁香蓼的株防效达75%以上,鲜重防效达82%以上;对总草的鲜重防效达83%以上。无患子提取物与甲草胺(含量20%)、噁草酮(含量6%)复配,在化学除草剂用量减半的情况下,依然表现出突出的除草效果。无患子提取物与甲草胺复配,在4500 mL·hm-2的用量下,施药后15 d和30 d,对马唐、莎草的株防效分别达90%和94%以上;对丁香蓼的株防效达79%以上;对总草的鲜重防效达88%以上。无患子提取物与噁草酮复配,在3600 mL·hm-2的用量下,施药后15 d和30 d,对马唐、莎草的株防效分别达94%和96%以上;对丁香蓼的株防效达94%以上;对总草的鲜重防效达96%以上。本研究结果对于减少化学除草剂的用量,减少化学农药对环境的污染,在一定程度上降低农产品农药残留风险,具有重要的参考价值,为无患子资源的开发利用,提供了理论依据。  相似文献   

20.
为了解石河子垦区的CDV流行株H基因遗传变异特点,设计2对特异性引物,通过RT-PCR方法对29份临床疑似犬瘟热的病料进行检测,对于检测CDV阳性的病料进行流行株H基因克隆、测序和序列分析,结果检测出7份阳性病料。序列分析发现,7个流行株H基因之间的同源率在91.0%~98.9%,与疫苗株(FJ461699.1)的同源率为86.9%~91.7%,存在一定的变异。糖基化位点及抗原表位预测分析发现,与参考株Onderstepoort相比,7个流行株推导的H蛋白糖基化位点、抗原表位均有不同程度的改变。遗传进化分析显示,CDV shz1~CDVshz6亲缘关系较近,它们与CDVshz7相距较远。研究结果提示,石河子垦区发病犬中存在CDV变异株。  相似文献   

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