RHO1基因的HIGS表达载体构建及转基因水稻的抗病性分析

【目的】使用Gateway技术构建稻瘟菌RHO1基因寄主诱导的基因沉默(HIGS)表达载体,将其转化入水稻后,观察稻瘟菌对转基因水稻的致病力。【方法】利用PCR技术从稻瘟菌cDNA扩增RHO1基因,通过Gateway技术构建pBDL03-RHO1载体,电转化进入农杆菌AGL1;以水稻日本晴为材料,通过农杆菌介导的转化方法获得转基因水稻植株,并对其接种稻瘟菌,分析转基因水稻对稻瘟菌抗性。【结果】通过PCR扩增获得了RHO1基因片段,利用BP反应构建了入门载体pDONR 221-RHO1,采用LR反应构建了HIGS表达载体pBDL03-RHO1。通过农杆菌介导的转基因方法将HIGS载体转入了水稻中,并利用mCherry红色荧光观察和PCR扩增验证了转基因植株构建成功。接种试验结果表明,HIGS转基因植株对稻瘟菌的抗性提高。【结论】利用Gateway技术可以简单快速构建HIGS表达载体,表达RHO1的转基因水稻抗病性提高,表明RHO1介导的HIGS在水稻-稻瘟菌互作过程中可以发挥作用。     

稻瘟菌培养液活性物质诱导水稻抗稻瘟病的研究

将液体培养的稻瘟菌(Magnaporthe grisea)ZC13菌丝过滤后,经减压浓缩、乙醇沉淀、双蒸水悬浮、透析、离心,得到滤液活性物质(Cultural fluids filtrated substance,CFS).测定结果表明,CFS含糖量为41.88 mg/mL葡萄糖当量.CFS在体外对稻瘟菌的孢子萌发和菌丝生长均无抑制作用,但处理水稻后可以显著提高水稻对稻瘟病菌的抗病性,在亲和性品系中,诱导抗病效果最高可达49.56%,且浓度与活性间存在正相关趋势,在非亲和品系中,CFS处理引起HR反应.CFS处理后,水稻POD和PAL活力明显升高.     

稻瘟菌粗毒素对水稻成熟胚愈伤组织的影响

以生产上大面积推广的杂交水稻恢复系蜀恢527和西南科技大学自育优质高产杂交水稻恢复系“2330”为材料．研究目前四川地区的稻瘟优势菌株稻瘟菌粗毒素对水稻成熟胚愈伤组织诱导、生长和分化的影响。结果表明，在优势稻瘟菌株A2中，随着稻瘟菌粗毒素浓度的提高．水稻愈伤组织的诱导率和分化能力显著降低，“2330”的最低诱导率为16．7％，蜀恢527只有12、5％：愈伤组织的致死率随毒素浓度的提高而增加．其最高致死率达到100％。在混合毒素培养基中粗毒素浓度为30％的处理选择效率较合适．但是增加毒素浓度可以进一步提高选择效果和提高得到抗性突变苗的几率。     

稻曲病田间简易接种方法——厚垣孢子直接喷雾法

介绍一种简易稻曲病田间接种方法(厚垣孢子直接喷雾),包括菌源的采集保存、水稻种植过程、接种体制备、接种实施过程以及最终接种效果,为水稻新品种对稻曲病的抗性田间鉴定、杀菌剂新品种对稻曲病的田间药效试验提供一种简易可行的操作方法,从而为水稻生产上新品种、新药剂的选择提供保障。     

东乡野生稻稻曲病人工接种技术研究

为了建立准确的东乡野生稻稻曲病人工接种技术,本研究对水稻生长时期、接种体、接种时间及接种方法对接种效果的影响展开了研究。结果表明:接种体菌丝片段-分生孢子混合液最有利于诱导稻曲病的发生;在16:00～17:00接种更有利于稻曲病的发病;注射接种方法比喷雾接种法的发病效果更好;以上3个因素对东乡野生稻稻曲病诱发的影响与对照品种两优培九一致;东乡野生稻稻曲病最佳诱发时期为剑叶与倒二叶叶枕距为(4±0.5)cm时,这与两优培九的(6±0.5)cm不同。     

东乡野生稻稻曲病人工接种技术研究

为了建立准确的东乡野生稻稻曲病人工接种技术,本研究对水稻生长时期、接种体、接种时间及接种方法对接种效果的影响展开了研究。结果表明:接种体菌丝片段-分生孢子混合液最有利于诱导稻曲病的发生;在16:00～17:00接种更有利于稻曲病的发病;注射接种方法比喷雾接种法的发病效果更好;以上3个因素对东乡野生稻稻曲病诱发的影响与对照品种两优培九一致;东乡野生稻稻曲病最佳诱发时期为剑叶与倒二叶叶枕距为(4±0.5)cm时,这与两优培九的(6±0.5)cm不同。     

稻瘟菌毒素对水稻生理生化的影响

综述了稻瘟菌毒素对水稻生理结构和生化特性的影响。明确了稻瘟菌毒素可对水稻植株生长特性、细胞结构、相关酶活性产生较大影响,毒素对水稻的影响效应与病原菌相似。     

稻曲病接种菌源及接种方法的研究

试验筛选出两种致病力较强的接种菌源，稻曲病菌在ＰＤ、ＰＳ两种培养液中分生孢子产生量可达１０８个／毫升以上，用适温高湿可以部分地打破老熟厚垣孢子休眠。本试验首次进行了稻曲病菌白化菌株的分离、培养研究，用培养的白化菌株在水稻孕穗期接种成功。在相同条件下，注射接种成功率明显高于喷雾接种。接种后的相对低温处理有利于病害发生。作者认为接种菌源与接种后的温度是人工接种成功的关键因子。     

稻瘟菌拮抗细菌的筛选与鉴定

从不同水稻根际土壤样品中分离纯化了486株细菌。采用平板测定法和微培养离体测定试验获得12株对稻瘟菌有不同程度抑制作用的拮抗细菌。结果表明:B4,B8,B18,B31,B34,B73和B74等菌株对稻瘟菌菌丝生长抑制率均在80%以上,其培养液100%抑制稻瘟菌孢子萌发;同时对水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、草莓炭疽病菌和黄瓜枯萎病菌等多种病原真菌有较好抑制作用,经鉴定该组拮抗细菌为枯草芽孢杆菌。B1,B43和B44菌株对稻瘟菌菌丝生长和孢子萌发有较好抑制作用,对水稻纹枯病菌具有一定的抑制作用,经鉴定为短小芽孢杆菌。B48和B59为链霉菌,对稻瘟菌的抑菌带明显,但对稻瘟菌孢子萌发和附着胞的形成抑制作用不明显。     

稻瘟菌附着胞分化相关基因研究进展

由稻瘟菌[Magnaporthegrisea(Herbert)Barr,无性世代为Pyriculariagrisea(Cooke)Saccardo=PyriculariaoryzaeCavara]引起的稻瘟病是水稻最严重的真菌病害之一,每年给水稻生产带来重大的经济损失。稻瘟菌与水稻的互作符合基因对基因关系,现已被作为模式系统用于研究病原微生物-植物寄主的互作机理。稻瘟菌致病分子机制的研究不仅为病害的防治奠定理论基础,也为其它植物病原真菌的研究提供借鉴。本文对稻瘟菌侵染结构附着胞分化的相关基因研究进展进行综述。     

稻瘟病诱导抗性研究初报

 首先鉴定单孢分离菌株20-6,20-7,20-21,20-3,分别为稻瘟病菌生理小种ZB₂₅,ZC₉,ZD₁,ZA₅₇． 然后又分别由相应发病鉴别品种叶上再分离以获得ZB₂₅,ZC₉,ZD₁,ZA₅₇4个小种,根据各个小种对我国一套稻瘟病菌生理小种鉴别品种的反应型,其对一定的品种为致病菌,而对另外的品种则为非致病菌。先用非致病菌作“诱发接种”（inducing inoculation）,然后再以致病菌作“挑战接种”（challenge inoculation）,结果表明,稻株可产生不同程度的诱导抗性。     

黑龙江省稻瘟病菌与水稻品种的互作分析

为探明黑龙江省主要稻区的稻瘟病菌与水稻主栽品种互作关系,采用水稻苗期接种病原菌的方法,测定了来自黑龙江省7个水稻主要种植区的55个稻瘟病菌菌株对20个黑龙江省生产上应用的水稻品种的致病力及品种的抗性.结果表明,黑龙江省稻瘟病菌的致病力存在明显分化现象,存在地域差异,不同地区采集的菌株对供试品种的致病力有差异.齐齐哈尔和...     

福建省水稻新品种对稻瘟病菌的抗性鉴定与评价

2004~2005年对福建省18个水稻新品种进行了苗期人工接菌和田间病圃自然诱发抗稻瘟病鉴定。结果表明,参试品种对1996年以前分离的稻瘟病菌株群体抗性水平高于2003和2004年分离的稻瘟病菌株。不同水稻产区采集的菌株对水稻新品种致病性有差异,以福建省的宁德、三明、龙岩三个地区的菌株致病性较强,水稻新品种室内苗瘟和田间穗颈瘟的鉴定结果较为一致。通过分析,认为宜香优673、D优15和冈优148三个水稻新品种抗病性较好,可考虑在生产上示范应用。     

膜脂过氧化与水稻对稻瘟病抗性的关系

喷雾接种稻瘟菌后测定了水稻幼苗叶片内丙二醛含量及相对电导率的变化。结果表明：表现非亲和反应的水稻H8R叶片中丙二醛含量及相对电导率在接种后18 h开始增加，均于30 h和60 h形成一小一大的峰值，这正是水稻叶片过敏性坏死斑出现到形成时；而在亲和反应的H8S叶片中二者均只在接种后48～72 h间有一个相对升高期，其增幅均低于非亲和反应。同时证明，接种后30 h，H8R叶片中亚麻酸和亚油酸含量明显降低，而在亲和反应中基本不变。非亲和反应的水稻叶片中脂氧合酶活性在接种后18 h开始上升，在24 h和72 h分别出现两个峰值；亲和反应中该酶活性在互作后期（60～72 h）略有增加。这些结果说明脂氧合酶活性变化与膜脂过氧化表现明显的时间动态相关，膜脂过氧化引起的电解质渗漏是过敏性反应的主要生理机制之一。     

中国部分杂交稻和常规早籼、晚粳品种(系)的抗瘟性

 选用来自中国18个省、市,12个小种分属于9个不同谱系的30个具有广谱毒性的稻瘟病菌株,人工接种于已知抗瘟基因型的品种(系)及中国20世纪90年代新育成的部分杂交稻和常规早籼、晚粳品种上进行水稻抗病性鉴定。通过具有广谱毒性并能识别抗病基因的30个菌株,与具有不同抗性类型并携带有不同或与之相连锁的抗性基因的品种及已知抗性基因的国际鉴别品种进行比较,以期推测某些中国品种的抗性基因。结果表明,部分优异抗瘟材料及新育成的杂交稻组合和常规早籼、晚粳稻品种(系)能抗多数近年采集分离的田间致病菌株,是育种和大面积推广种植     

Resistance Evaluation of Some Hybrid Rice, Conventional Early Indica and Late Japonica Rice to Magnaporthe grisea

Thirty isolates of Magnaporthe grisea collected from 18 provinces/cities representing 21 pathotypes and 9 different lineages were inoculated to rice varieties with known resistance genes and some hybrid rices,conventional early indica and late japonica varieties cultivated recently in China.Virulence spectrum of the 30 isolates was very different,showing that they recognize numerous different resistance genes.Varieties also revealed very different resistance patterns showing that they carry different resistance genes or combinations of resistance genes.On the basis of comparisons with international differential varieties with known resistance genes,resistance genes in certain Chinese varieties could be speculated.The results indicated that some of them were resistant to most of the isolates tested and that they could be of interest as resistance sources for hybrid parents or to be planted in the field directly.     

湖南省103个水稻品种的抗瘟基因型鉴定

用离体接种的方法,利用22个已知无毒基因菌株,对湖南省103个水稻品种进行了抗瘟基因型鉴定和系统聚类分析.结果表明:在阈值为0.78时,可将103个品种分为13类,其中有9类81个品种可能携带已知的抗病基因,其余4类22个品种可能含有未知的抗病基因.另外,具有广谱抗瘟基因Piz5(Pi2)、 Pizt、Pi1和Pi9的品种对鉴别菌株的抗菌频率均大于60.0%.     

源自杂交稻组合五优308 稻瘟病菌致病性分析

对采自广东韶关、河源、梅州等稻区严重感染稻瘟病的杂交稻组合五优308穗瘟标样进行了稻瘟病菌分离,获得源自不同地点的穗瘟标样分离物18个,利用7个中国稻瘟病菌小种鉴别品种和11个单基因系对分离物进行了致病性分析.结果表明:所分离菌株鉴定出ZB13、ZB15、ZC13等3个小种,分别占分离菌株的66.67％、27.78％、5.56％;对分离菌株表现出高感的抗性基因有Pi-ta2、Pi-sh、Pi-i,对分离菌株具有抗性较好的基因有Pi-kh、Pi-1、Pi2、Pi-9及Pi-50等;所有分离物均能回接上杂交稻五优308,使接种品种表现感病.选取GDHY-308-1401等3个菌株对广东部分品种(组合)进行了致病性测定,在测定的45个品种(组合)中,表现感至高感的品种(组合)有13个,占28.89％;中感的有2个,占4.44％;中抗至高抗的有30个,占66.67％.其中与五优308同一类型的杂交稻组合五丰优9802、五优613、五优1179对接种菌株表现出良好抗性,在五优308感病的稻区可考虑种植上述抗病品种.     

福建省稻瘟病菌毒性类型及部分水稻品种(组合)抗病性

测定了2003-2006年从福建省主要稻区分离挑选的97个稻瘟病单孢菌株对国际水稻所CO39近等基因系(near-iso-genic lines,NILs)6个鉴别品种和部分水稻品种的致病性.结果表明,福建省稻瘟病菌株分别属于14个毒性类型,优势类型和亚优势类型分别是I34.1和I35.1,其对8个福建主栽品种的毒力频率分别为51.96%和60.23%.2003-2006年各年度的菌株多样性指数分别为0.6324、0.5541、0.6000和0.7699.相邻年度间的病菌毒性类型相似率分别为57.14%、54.55%和46.15%.说明福建省稻瘟病菌毒性类型在各年份间的分布呈现不同的特征.CO39-NILs中C101LAC(Pi-1),育种亲本中R527、亚恢627、多系1号和谷丰A,主栽品种中D优527、D奇宝优527和T优5537对稻瘟病菌的抗性好,抗性表现均为抗(R);95个新育成的品种中表现抗(R)和中抗(MR)的分别占16.84%和22.11%,其中新品种谷优5188、特优18、天优3301、Ⅱ优907、Ⅱ优516和D奇宝优5号的抗性频率高于90%,且对田间叶瘟和穗瘟的抗性表现较好,说明这些抗性品种及其所携带的基因是福建省育种的良好材料.     

2009年江西省主推早稻品种穗瘟抗性的评估

利用稻瘟病菌8个强致病力单孢菌株,测定了2009年江西省主推早稻品种离体穗颈节段对稻瘟病的抗性。结果表明,株两优02对穗瘟的抗性最好,平均病级为0.13,测定为抗病品种;株两优09、T优898、金优463与淦鑫203的平均病级分别为1.25、1.63、2.88和3.00,中抗稻瘟病;陆两优996、春光1号和金优71的平均病级分别为3.88、4.13、4.75,中感稻瘟病;先农37与金优458的平均病级分别为5.25、6.0,测定为感病品种;对照品种丽江新团黑谷发病最重,其病级为8.50,属于高感稻瘟病品种。上述结果的准确性需要在今后特别是2010年的农业生产中验证。