猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

从山西某猪场发病猪的脑组织中分离到1株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)毒株,通过BHK-21细胞培养、病毒毒力滴定、中和试验、PCR检测病毒方法对该分离株进行了鉴定,结果发现:分离的病毒在BHK-21细胞培养盲传4代后出现典型细胞病变;用BHK-21细胞测定其毒价TCID50为10-8.042/0.1 mL;PCR体外扩增可见其扩增片段与预期目的条带相一致;据此分离病毒株的上述特征,鉴定该病毒为猪伪狂犬病病毒,并命名为SX09。     

猪源伪狂犬病病毒变异株传代致弱株LA2017株的获得与鉴定

将猪源伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的强毒变异株AH02LA株在鸡胚成纤维细胞上进行连续传代,获得了不同代次的弱毒株,检测其安全性、免疫效力、生长特性及稳定性,并对其gE基因上、下游片段进行测序.对PRV AH02LA株的F151代进行3轮挑斑纯化,获得了1个毒株并将其命名为PRV LA2017株.用该毒株接种(剂量为106.00TCID50/头)试验猪,在接种后14 d内无任何临床症状;在免疫(106.00TCID50/头)后21 d攻毒(106.50TCID50/头),所有试验猪未出现任何猪伪狂犬病症状,体温正常,没有排毒.在攻毒前用ELISA检测,PRV gB抗体全部为阳性,PRV gE抗体全部为阴性;在攻毒后14 d这两种抗体均为阳性,体现出良好的安全性与保护性.对照组BarthaK61在攻毒后试验猪全部发病,体温高至40.5℃以上,且均检出排毒.测序结果显示LA2017株的gI部分基因与gE全部基因缺失.该毒株在CEF细胞及ST细胞上生长良好,在CEF上的滴度达到108.0TCID50/mL,在ST细胞上的滴度最高达109.5TCID50/mL,能满足活疫苗生产的要求.LA2017株安全性好,免疫效力强,生长滴度高,可以作为研制针对PRV变异株疫苗的候选毒株.     

猪伪狂犬病毒的分离与鉴定

从河南某发病猪场大批死亡仔猪的脾、肾及脑组织中分离到1株猪伪狂犬病毒(PRV)毒株,该毒株经细胞连续传代培养后,接种PK-15细胞能够产生明显的细胞病变(CPE),且能被PRV阳性血清中和.病毒对氯仿、乙醚敏感,56℃水浴30 min能使其灭活.将所分离的病毒接种家兔和小鼠,均出现明显的伪狂犬病临床症状.PCR鉴定结果表明,用gp50基因序列引物能够从该毒株上扩增出目的条带,将测序结果与GenBank中的5株PRV毒株进行比对分析,同源性达99％.证实所分离病毒为猪伪狂犬病毒.     

潍坊某猪场一起伪狂犬病的诊治

2014年9月山东潍坊某猪场发生疑似猪伪狂犬病疫情,采集病死仔猪的脑组织等,利用Vero细胞做病毒分离,并设计一对伪狂犬病病毒(PRV)gE基因片段的特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定及家兔接种试验.结果表明:脑组织上清液接种Vero细胞后有典型的细胞病变;PCR扩增产物电泳后显示出990bp长的目的片段,目的片段基因序列与6株PRV毒株的gE基因序列核苷酸同源性在97.7％～ 100％之间,证实该病毒为PRV;分离病毒接种家兔出现典型的伪狂犬病症状.临床诊断结合实验室鉴定以及动物接种试验,确诊该病例为猪伪狂犬病.     

猪伪狂犬病病毒流行株gE基因的遗传变异分析及其对仔猪致病性的初步研究（英文）

[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用Vero细胞从疑似伪狂犬病病毒(PRV)引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株g E基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株PRV毒株,命名为PRV N5B株,该病毒能在Vero细胞上增值,在15代TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;g E基因全长1 740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%~100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒(106/0.1 ml)滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的PRV N5B分离株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。     

猪源伪狂犬病病毒变异株传代致弱株LA2017株的获得与鉴定

将猪源伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)的强毒变异株AH02LA株在鸡胚成纤维细胞上进行连续传代,获得了不同代次的弱毒株,检测其安全性、免疫效力、生长特性及稳定性,并对其gE基因上、下游片段进行测序。对PRV AH02LA株的F_(151)代进行3轮挑斑纯化,获得了1个毒株并将其命名为PRV LA2017株。用该毒株接种(剂量为10^{(6.00 )}TCID_(50)/头)试验猪,在接种后14 d内无任何临床症状;在免疫(10(6.00 )TCID_(50)/头)试验猪,在接种后14 d内无任何临床症状;在免疫(10^{(6.00 )}TCID_(50)/头)后21 d攻毒(10(6.00 )TCID_(50)/头)后21 d攻毒(10^{(6.50 )}TCID_(50)/头),所有试验猪未出现任何猪伪狂犬病症状,体温正常,没有排毒。在攻毒前用ELISA检测,PRV gB抗体全部为阳性,PRV gE抗体全部为阴性;在攻毒后14 d这两种抗体均为阳性,体现出良好的安全性与保护性。对照组BarthaK61在攻毒后试验猪全部发病,体温高至40.5℃以上,且均检出排毒。测序结果显示LA2017株的gI部分基因与gE全部基因缺失。该毒株在CEF细胞及ST细胞上生长良好,在CEF上的滴度达到10(6.50 )TCID_(50)/头),所有试验猪未出现任何猪伪狂犬病症状,体温正常,没有排毒。在攻毒前用ELISA检测,PRV gB抗体全部为阳性,PRV gE抗体全部为阴性;在攻毒后14 d这两种抗体均为阳性,体现出良好的安全性与保护性。对照组BarthaK61在攻毒后试验猪全部发病,体温高至40.5℃以上,且均检出排毒。测序结果显示LA2017株的gI部分基因与gE全部基因缺失。该毒株在CEF细胞及ST细胞上生长良好,在CEF上的滴度达到10^{(8.0 )}TCID_(50)/mL,在ST细胞上的滴度最高达10(8.0 )TCID_(50)/mL,在ST细胞上的滴度最高达10^{(9.5 )}TCID_(50)/mL,能满足活疫苗生产的要求。LA2017株安全性好,免疫效力强,生长滴度高,可以作为研制针对PRV变异株疫苗的候选毒株。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE基因的遗传变异分析及其对仔猪致病性的初步研究

[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用 Vero 细胞从疑似伪狂犬病病毒（PRV）引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株 gE基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株 PRV 毒株,命名为 PRV N5B 株,该病毒能在 Vero 细胞上增值,在15代 TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;gE基因全长1740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%～100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒（106/0.1 ml）滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的 PRV N5B分离株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

从天津市郊县某猪场发病仔猪脑中分离到一株病毒。该病毒接种鸡胚绒毛尿囊膜有白色的痘斑出现,接种PK-15和BHK-21细胞出现典型的细胞病变,毒价(TCID50)为10-6/mL,且能被PRV阳性血清中和;将病毒给家兔注射后出现典型的伪狂犬病症状并导致死亡。通过上述试验结果证明,该分离毒株为伪狂犬病毒。     

广西猪伪狂犬病病毒GXA株的分离鉴定

从广西某猪场大批死亡的新生仔猪分离1株病毒，该病毒株在PK-15出现细胞病变，在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子，细胞培养物接种家兔出现伪狂犬病症状。进而用所分离病毒的DNA作为模板，应用特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增出伪狂犬病病毒gp50基因中433-651之间217bp长的特异性片段。分离的病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒GXA株。     

伪狂犬病病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增伪狂犬病病毒(PRV)的gB基因片段,构建含有gB基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRV-gB基因重组质粒为模板应用SYBR Green I方法来建立检测PRV-gB基因载量的荧光定量PCR方法。结果显示:在(8.6×107~8.6×101)copies/μL范围内,回归方程为y=-3.5604x+41.165,其决定系数为0.9993,显示出优良的线性关系;扩增产物的熔解曲线仅有一个特异性单峰。该方法对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪细环病毒等常见猪源DNA病毒进行检测时均没有扩增曲线,重复性试验的变异系数小于2%,表明建立了特异性强、重复性好、灵敏性高的PRV-gB基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。用该方法检测8种商品伪狂犬病弱毒活疫苗的每头份剂量的病毒载量,结果显示不同商品伪狂犬病弱毒活疫苗之间的病毒载量存在明显差异,与其标识剂量基本一致,表明该荧光定量PCR检测方法可用于疫苗剂量检测。