水稻黄单胞菌avrBs3/PthA家族基因研究进展

 水稻黄单胞菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）和稻生致病变种（X.oryzae pv.oryzicola，Xooc）分别引起水稻白叶枯病（bacterial blight，BB）和水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS），对中国和世界水稻产量造成较大损失。基因组学揭示，Xoo和Xooc不同小种中存在15～30个数量不等的avrBs3/PthA（avr/pth）家族基因。新近研究结果表明，avr/pth基因既是毒性基因，又是寄主植物先天免疫的抑制因子，还是与抗病基因（R）匹配的无毒基因。Xooc中虽然存在avr/pth基因，但因存在能够抑制avr/pth无毒基因功能的抑制因子，故而未在水稻中发现抗BLS的R基因。除结构上的共有特征外，avr/pth基因间的差异主要表现在102 bp重复单元在每个avr/pth基因中的重复数多少上。avr/pth基因的进化可能由简单进化为复杂，这可能是Xoo和Xooc致病性变异的主要原因。     

水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）合成基因，avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点，把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上，获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上，获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105，把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99，通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现，lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示，基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关，前两基因的突变导致细菌完全失去毒性，而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型，在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此，本试验证明，以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PX099△avr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr.PXO99A及其突变体基因组DNA以内切酶BamH Ⅰ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱.进一步以相同探针检测PXO99A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆.众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列.经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同.因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除.将此文库克隆(p5)分别导入PXO99A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因.同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能.     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PXO99Δavr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99~A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr。PXO99~A及其突变体基因组DNA以内切酶BamHⅠ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱。进一步以相同探针检测PXO99~A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆。众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列。经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同。因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除。将此文库克隆(p5)分别导入PXO99~A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99~A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因。同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能。     

无毒基因avrXa3介导的水稻白叶枯病菌在不同水稻品种上的致病适应性分析

水稻白叶枯病菌[Xanthomonas oryzaepv.oryzae(Ishiyama)Dye]是水稻上重要的细菌病害之一,探明无毒基因avrXa3和含不同抗病基因水稻品种间的互作对于制定有效的病害防治措施有着重要的意义。根据无毒基因avrXa3的序列,构建了水稻白叶枯PXO99A菌株缺失5个串联的无毒基因的突变体PXO99△avr。将avrXa3导入PXO99A和PXO99△avr后,得到衍生菌株PXO99A/avrXa3,PXO99△avr/avrXa3,与36个含不同抗病基因的水稻品种进行互作分析。结果显示,导入avrXa3后的菌株在不同的水稻品种上表现出明显的寄生适应性变化。进一步分析证明无毒基因avrXa3在Wase Aikoku 3、IRBB2、IRBB3、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB211、IRBB53、IR24、TN-1等11个水稻品种上病斑缩短,表现明显的无毒活性;在IRBB21、IRBB10、IRBB14、IR26、Cas209、Java14这6个品种上病斑明显变长,体现无毒基因的毒性功能。表明无毒基因avrXa3对PXO99A中其他无毒基因的表达有明显的干扰作用,单个效应分子的变化也会使细菌在不同水稻品种上的寄生适应性发生复杂的改变。     

水稻白叶枯病致病性基因研究进展

稻黄单胞菌水稻致病变种[Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)]可引起水稻白叶枯病,是水稻病害中最严重的病害之一,其与水稻互作是基因对基因的关系。Xoo基因组测序的完成极大推动了对Xoo基因功能的研究。为此,该文对近几年来Xoo致病性基因的鉴定情况进行统计,并就致病性基因的突变菌株对水稻接种情况和菌株自身变化进行了归纳,较为详细阐述了当前对Xoo无毒基因的鉴定研究状况,为水稻抗白叶枯病育种以及研究致病基因和致病机制提供理论基础。     

水稻白叶枯病菌tatB基因的克隆及功能分析

根据水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99的tatB基因序列设计引物,采用PCR方法从PXO99中克隆了tatB基因,命名为tatBXoo。通过同源重组的方法,构建了tatBXoo的插入突变株TBM,在含有X-gluc的抗性平板上筛选,并经Southern blot杂交验证确认。表型测定结果表明:与野生型相比,tatB突变株在水稻(寄主)上的致病性减弱,但在烟草(非寄主)上仍具有引起过敏反应的能力;tatB突变导致Xoo致病相关的重要表型如胞外多糖减少,游动性及趋化性减弱。但是,tatB突变不影响Xoo在基本培养基(MMX)中正常生长、胞外纤维素酶产生和生物膜形成。     

水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物基因hpaF与毒力相关

【目的】稻黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)PXO99A菌株中PXO_03420基因被注释为编码具有多个LRR的Ⅲ型效应物基因hpaF,本研究旨在明确hpaF基因的功能,为完善XooⅢ型效应物的研究提供一定的理论基础.【方法】通过同源双交换构建hpaF基因的缺失突变体,并通过表型分析、致病性试验和遗传互补对该基因的功能进行研究.【结果和结论】本研究发现,hpaF基因突变后对水稻日本晴品种的致病力降低了51.81%,减弱了细菌在非寄主植物蓖麻上的过敏反应.而带有hpaF全基因片段的pLAFR3能够恢复hpaF突变体的致病表型,结果表明hpaF基因与水稻白叶枯病菌的致病性相关.     

水稻白叶枯病菌PXO99A无毒基因缺失突变的研究

对同源重组获得的水稻白叶枯病菌PXO99A菌株的无毒基因突变体PXO99△avr进行Southern杂交验证、突变序列分析和致病性测定.结果表明:该突变体缺失了5个无毒基因,同源重组发生在PXO99A全基因组中一个有5个无毒基因串联的位点上;与PXO99A相比,突变体在IRBB10等15个水稻品种上引致的病斑明显缩短,而在IRBB14、IRBB21和IRBB55上的病斑则变长;缺失的5个无毒基因的综合表现为毒性因子功能.推断:在缺失的基因中含有无毒基因avrXa14、avrXa21、avrxa13以及与抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa10、Xa17亲和互作有关的毒性因子.     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

水稻白叶枯病菌毒性表达的负调控因子PXO_02944的分子鉴定

【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。     

云南水稻白叶枯病生理小种初析及鉴别品种的筛选

 从云南省10个地州40个县市的水稻白叶枯病标本中分离纯化得到115个水稻白叶枯病菌株。利用已知抗性基因的近等基因系,在孕穗期应用剪叶法接种明确其生理小种。并筛选出一套鉴别品种IRBB1,IRBB3,IRBB4,IRBB5,IRBB7,IRBB13,IRBB14,IRBB18,IRBB21. 云南省的水稻白叶枯病菌小种组成复杂,有自身的特殊性。已鉴定出25个小种,暂定名为YN1～YN25. 优势生理小种为YN1,YN13,YN21,其中YN13分布于楚雄、玉溪、红河、丽江等4个地区共8县（市）,YN21分布于大理、红河等地区。云南的小种多样性分布可能与它的地理条件有关。     

小粒野生稻抗白叶枯病新基因的鉴定与初步定位

【目的】将小粒野生稻（Acc. No. 101133）的抗白叶枯病基因导入栽培稻IR24,并对其进行鉴定和分子标记定位,以便应用于育种实践。【方法】以小粒野生稻和栽培稻IR24的BC2F2群体及其F3、F4家系为材料,利用分离集团分析法（BSA）,借助SSR标记对Xa35(t)进行分子标记定位。【结果】通过对抗病基因进行抗谱鉴定和遗传分析,结果表明,该基因对白叶枯病菌株PXO86和PXO99表现感病,而对PXO61、PXO112和PXO339表现抗病,初步将其定位于水稻的第11染色体长臂上,同标记RM144共分离,并位于标记RM7654和RM6293之间,与两标记的遗传距离分别为1.1 cM和0.7 cM。【结论】小粒野生稻（Acc. No. 101133）含有新的抗白叶枯病基因,暂定为Xa35(t)。     

西南地区水稻细菌性条斑病菌致病力的分化

以水稻品种IRBB4、IRBB5、IRBB14、IRBB18、IRBB21和IR24为鉴别品种,在孕穗期,采用针刺接种的方法,将水稻条斑病菌接种在水稻剑叶上,根据病菌与品种互作反应和亲和性的类型差异,将供试的75株条斑病菌菌株区分为13个小种群.大多数水稻条斑病菌株在鉴别品种上的互作反应表现为弱互作模式.云南、贵州、四川3省菌株小种组成的比较表明:以小种C9为目前3省的共同优势种群;云南省小种组成多样,所有的小种均有分布,贵州小种类型有6、9、11、13,四川小种类型有3、4、6、7、9、11、12、13,小种的分布受地理区域的影响.     

水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系的建立

水稻细茵性条斑病菌存在至少20个avrBs3/pthA家族成员,但其在水稻上的毒性或无毒性贡献并不清楚.本文依据avrBs3/pthA结构上的保守性,利用同源重组策略,借助自杀性载体pKMS1介导,对水稻条斑病菌中的avrBs3/pthA家族基因进行敲除.结果发现:同源交换可通过基因内和基因间重组实现avrBs3/pthA家族的基因敲除;PCR和Southern杂交结果显示,水稻条斑病菌中有5个avrB5s3/pthA家族基因被成功敲除,表明水稻条斑病菌avrBs3/pthA家族基因敲除体系构建成功.这为逐一评价avrBs3/pthA 家族基因的毒性或/和无毒性功能奠定了基础.