H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

【目的】制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持。【方法】以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。【结果】经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为2~7~2~(10),腹水HI效价为2~(16)~2~(19);单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于Ig G1亚类,其轻链均为K链。3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应。3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好。【结论】用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性。     

抗禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的研制

以H9亚型禽流感病毒免疫Balb／C小鼠，细胞融合后用血凝抑制试验检测细胞培养上清，结果获得3株阳性细胞株，分别命名为6E6、6B6、5B4。经2次亚克隆后，所有杂交瘤细胞保持了分泌抗禽流感H9亚型特异抗体的能力。特异性试验证明，3株单克隆抗体仅与试验的H9病毒株反应，与H5亚型禽流感病毒、鸡新城疫病毒和鹅源腺病毒等不反应。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明，3株单克隆细胞的上清均能与感染H9亚型病毒的鸡成纤维细胞呈特异性绿色荧光反应。实验性病毒检测结果表明，IFA方法检测H9禽流感比鸡胚接种分离病毒的效果好、灵敏度高，是一种经济实用的方法。获得的单克隆抗体可在禽流感流行病学的监测及预警预报中发挥重要作用。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

禽流感(AI)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的一种发生于禽类的病毒性传染病。笔者以杂交瘤技术研制抗AIV共同抗原的特异单克隆抗体,旨在建立一种双抗体夹心ELISA方法快速检测AIV,以便为A型AIV的快速诊断技术的研究提供理论依据。1材料与方法1.1材料病毒。H9亚型AIV株(AIV-H9)、新     

H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

用纯化的H5亚型禽流感病毒(AIV)抗原免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选,获得9株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中4株能高效分泌血凝素(HA)蛋白特异性的单克隆抗体.特异性试验表明,IE6单克隆抗体仅与试验的H5病毒株反应,而不与新城疫病毒(NDV)、H9亚型AIV和产蛋下降综合症病毒(EDSV)反应.这9株单克隆抗体分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM亚类,κ轻链.     

单抗介导的血凝试验对H9N2亚型禽流感病毒的研究

利用4株鼠源抗H9N2禽流感病毒血凝素单克隆抗体与标准H9N2禽流感多克隆抗体,通过血液凝集抑制试验(Haemoglutination inhibition test,HI)分别对25株H9N2禽流感病毒进行了检测,发现4株单克隆抗体均对其中的23株H9N2禽流感病毒反应,其最高HI效价分别为:A单抗12log2,B单抗12log2,C单抗12log2,D单抗12log2;最低分别为:A单抗3log2,B单抗9log2,C单抗4log2,D单抗6log2,而对其中的2株H9N2禽流感病毒没有HI反应,其HI价均为0;然而,标准多抗对25株H9N2禽流感病毒均产生HI反应。检测结果表明2株H9N2AIV毒株血凝素蛋白出现了抗原漂变。     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒（AIV）抗原的双抗体夹心ELISA方法。经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件：兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1：8000（浓度为3.531μg/ml）,抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1：800,酶标二抗的工作浓度为1：4000。与其他禽易感病毒（NDV、IBV、EDS-76V）等均没有交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可应用于AIV的检测和流行病学调查。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究（英文）

Five monoclonal antibodies(Mabs)to nuclear protein of avain influenza virus(AIV)were developed by syncretizing SP 2/0 and the spleen cells from BALB of mice immuized with H9 subtype AIV.Specificity of these Mabs were identified by immunofluorescent assay(IFA)and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).These five Mabs which were named as AIV-NP-2C3,AIV-NP-6A5,AIV-NP-3H9,AIV-NP-7B4,AIV-NP-2H4 could react with all viruses of AIV-H9 strains in tests.The result of Western blotting showed that only the 60 ku protein antigen of AIV-H9 could be recognized by the Mabs but never recognized by New castle disease virus,REV and infectious bursa disease virus.The result of preliminary application showed that avian influenza viruses could be dectected by Mabs in IFA and ELISA.All these Mabs will probably play important roles in preventing and monitoring avian influenza viruses.     

转化型人参皂苷对单克隆抗体生成的影响

以转化型人参皂苷的8个组分,按12.50和6.25μg·mL-1的剂量,以培养抗禽流感(AIV)H9亚型血凝素特异性单克隆抗体6E6株杂交瘤细胞和抗新城疫病毒(NDV)血凝素与神经氨酸酶单克隆抗体10B11株杂交瘤细胞,收集细胞培养上清,用血凝抑制试验(HI)和间接免疫荧光试验(IFA)检测单抗水平,探讨转化型人参皂苷对单克隆抗体生成的影响。结果表明;转化型人参皂苷3、4、7号组具有促进6E6单抗和10B11单抗生成的作用,其HI效价为26-27,与对照组(25)相比差异显著;IFA效价为104-105,与对照组(102)相比差异极显著。     

抗H9N2 AIV HA单克隆抗体的制备及其在胶体金层析检测中的初步应用

用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。     

抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究

禽流感（AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一种发生于禽类的病毒性传染病。笔者以杂交瘤技术研制抗AIV共同抗原的特异单克隆抗体，旨在建立一种双抗体夹心ELISA方法快速检测AIV，以便为A型AIV的快速诊断技术的研究提供理论依据。     

中药制剂SHY对新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒的抑制和攻毒保护效果

本试验利用蔷薇科植物提取物（SHY）分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用.结果表明：SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活（6/8）,病毒分离阳性.在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5/5、5/5、5/5和4/5.显示SHY不但能显著抑制新城疫、禽流感H9和H5亚型在鸡胚上增殖,而且能保护新城疫、禽流感H9亚型病毒的攻击.对SHY深入的研究,有望开发出有效抗禽流感药物.     

禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的研制和鉴定

应用杂交瘤技术,以低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株作为免疫原,制备出3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株C2C5、D3B10和C2H8。对单抗的特异性鉴定结果表明:腹水单抗C2C5、D3B10和C2H8的间接ELISA效价分别为5×214、210、5×212,但均无HI效价。3株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG2a。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示:单抗C2H8和D3B10与AIV H9N2和AIV H5N1均有60 kD的蛋白条带反应,而不与其他条带反应,表明这两株单抗特异性地针对AIV H9和AIV H5的共同抗原成分60 kD NP蛋白。而C2C5不与电泳蛋白条带反应,说明该单抗不是针对线性表位的,而可能是针对空间表位的。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较

将禽流感病毒(AIV)接种犬肾上皮细胞(MDCK),24h后以鸡抗禽流感抗体和兔抗鸡荧光抗体进行间接免疫荧光试验(IFA),结果于细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。利用96孔细胞板培养MDCK细胞,以间接免疫荧光作为判定指标对禽流感病毒进行毒力测定,并与禽流感病毒通用荧光反转录-聚合酶链反应(荧光RT-PCR)检测方法进行比较。结果表明间接IFA、荧光RT-PCR对同一样品检测的最高稀释度分别为10-5.25TCID50和10-6,Ct<30,两种方法对禽流感病毒的检测敏感性均很高。但由于荧光RT-PCR仅对抽提的RNA进行检测,而间接IFA是对禽流感活病毒进行检测,因此在临床样品检测和动物产品检疫中间接IFA更具准确性和实用性。     

Maternal Antibody Protected Chicks from Growth Retardation and Immunosuppression Induced by Early Reticuloendotheliosis Virus Infection

To determine if the maternal antibody from breeders vaccinated with cell culture-adapted reticuloendotheliosis virus （REV） could protect chicks from early REV infection, one-day-old chicks with or without anti-REV maternal antibodies were inoculated with REV, and then their growth rates and antibody titers to Newcastle disease virus （NDV） and avian influenza virus （AIV）, after vaccination with inactivated vaccines, were compared. This study indicated that REV infection could cause growth retardation and severely inhibit immune reactions to inactivated vaccines against NDV and Avian influenza virus （AIV, H9 and H5） in one-day-old broilers without maternal antibodies specific to REV. Maternal antibody from breeders vaccinated with an attenuated REV vaccine effectively protected REV-challenged birds from growth retardation and immunosuppression on antibody reactions to NDV and AIV vaccines. Four weeks after vaccination, the HI titers to NDV, AIV-H9, and AIV-H5 in maternal antibody positive and negative groups were 3.36 ＋- 2.04 versus 1.58± 1.69 （P〈0.01）, 6.27±3.87 versus 0.71 ± 1.60 （P〈0.01）, and 6.72±3.92 versus 0.54± 1.44 （P〈0.01）. Maternal antibodies from breeders vaccinated with REV vaccine could successfully protect chicks from REV infection and effectively prevent REV-induced growth retardation and immunosuppression in antibody responses to NDV and AIV.     

两株H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

采用Pharmacia的TimesavecDNAsynthesisKit结合RT-PCR方法，测定从鸡中的分离的2株H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA全基因cDNA序列。结果表明这2株AIV和从香港地区鸡、鹌鹑中分离的3株H9N2亚型的AIV的亲源关系很近，HA的氨基酸同源性全部高于95％，可能是来源于同一毒株；而与2株从火鸡中分离的H9N2亚型的AIV的来源不同。