小菜蛾化学感受蛋白突变体的构建(英文)

[目的]研究半胱氨酸(Cys58)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)与农药化合物结合特性的影响。[方法]利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1中Cys58突变成色氨酸(Trp58),获得突变体PlxyCSP1-M2。构建表达载体表达突变蛋白,并进行Western Blot检测。[结果]构建了突变基因的原核蛋白表达载体pET32a-PlxyCSP1-M2,并表达35kDa融合蛋白[结论]利用重叠延伸PCR法成功在原核系统中表达了PlxyC-SP1突变蛋白。     

重叠延伸PCR法构建小菜蛾化学感受蛋白1基因突变体研究

【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入PlxyCSP1的结合口袋,而无法进入PlxyCSP1-M的结合口袋。结合能预测显示,配体化合物与PlxyCSP1的结合能均为正值,与PlxyCSP1-M的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明,Cys32(TGC)已突变为Trp32(TGG),经IPTG诱导,该菌表达了分子质量约为36 ku的融合蛋白。【结论】Cys32是影响PlxyCSP1结构和功能的重要氨基酸残基。Cys32突变为Trp32后,PlxyCSP1-M结合特性发生了变化,不能与配体化合物正常结合。     

PPVSC-1株VP2基因的定点突变及真核表达载体的构建

以PPV VP2为基础,利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并将突变体克隆入pMD19-T Simple载体中;经酶切、PCR和测序鉴定后,利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点,定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建突变体与报告基因EGFP融合表达的pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)真核表达载体;利用脂质体法将重组质粒分别转染COS-7细胞。结果:成功构建了突变体的真核表达载体;在转染后的荧光观察中发现,pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)质粒转染细胞后,两者表达后的荧光信号不同,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品的荧光信号均匀分布于细胞中。提示,突变是引起表达差异的主要原因。     

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。     

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究(英文)

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。     

利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。     

猪传染性胃肠炎病毒M基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达.     

小麦Ra3基因编码区的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆小麦ramosa3(Ra3)基因完整编码区,利用原核表达系统表达并纯化获得重组的小麦RAMOSA3(RA3)。【方法】利用RT-PCR技术,从普通小麦"中国春"幼穗中扩增小麦Ra3,将其重组到原核表达载体pET-41a,并在T7Express competentE.coli菌株中进行诱导表达;利用Ni-NTA亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并通过Western印迹技术对其进行鉴定。【结果】获得了长度为1080bp的cDNA片段,该片段包含小麦Ra3完整编码区,编码产物长度为360个氨基酸残基,属于TPP酶家族成员;SDS-PAGE结果显示,菌体总蛋白中出现约66ku的预期条带,其表达量占总蛋白的44.6%;抽提液中加入体积分数0.3%的Triton X-100,可显著提高重组蛋白的溶解度;纯化后的重组蛋白呈单点纯,Western印迹结果进一步确证其为目标蛋白。【结论】利用原核系统高效表达并纯化获得了重组的小麦RA3。     

苜蓿MtCDPK1基因序列分析、克隆及表达载体构建

[目的]克隆苜蓿MtCDPK1基因,对其进行序列分析,并构建其表达载体。[方法]根据MtCDPK1基因的全长序列设计引物来克隆该基因,并用生物信息学方法对该基因表达的蛋白序列进行分析,最后通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体。[结果]试验成功克隆到了MtCDPK1基因,并证明MtCDPK1蛋白属于Ca2+依赖的蛋白激酶,同时成功构建了该基因的表达载体。[结论]该研究为苜蓿的遗传转化提供了良好的基础。     

牛病毒性腹泻黏膜病毒E2基因的原核表达与免疫原性分析

[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。     

红麻TIR1基因克隆及其表达载体构建

【目的】分析红麻运输抑制剂响应蛋白1(TIR1)基因在不同组织和不同发育时期花药中的表达情况,并构建其超量表达载体和干扰载体,为研究该基因在雄蕊发育中的调控功能打下基础。【方法】根据红麻花药转录组数据,利用生物信息学方法,克隆TIR1基因cDNA序列,实时荧光定量PCR(qPCR)分析TIR1基因在红麻保持系722B和不育系722A根、茎、叶及不同发育时期花药中的表达情况,并构建超量表达载体和干扰载体。【结果】TIR1基因的开放阅读框(ORF)为1761 bp,编码586个氨基酸(Gen Bank登录号KY613992)。qPCR检测结果显示,与不育系722B相比,不育系722A TIR1基因在四分体期花药中呈显著下调表达(P0.05,下同),在茎和双核期花药中呈显著上调表达,在单核期花药中极显著上调表达(P0.01);而在根和叶中,保持系722B和不育系722A中TIR1基因表达水平差异均不显著(P0.05)。超量表达载体p BI121-GFP-TIR1和干扰载体p ART27-p K-Tz-Tf构建成功。【结论】红麻TIR1基因编码一个富含亮氨酸重复的F-box蛋白。红麻不育系722A的单核期花药TIR1基因表达较保持系722B极显著上调表达,可能与花药败育有关。构建的超量表达载体和干扰载体,可用于红麻TIR1基因功能及其与雄蕊发育的关系研究。     

ETR1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。     

玉米EMS突变体库构建及突变体初步鉴定

[目的]构建玉米诱变变体库,创制玉米新种质资源.[方法]采用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变玉米优良自交系B73和郑58,构建变体库;选取小叶夹角突变体rla1、rla2进行密植产量测定和遗传学分析.[结果]2个突变体库的M2代含有表型丰富的突变体,尤其是一些突变体表现出优良农艺性状,如叶夹角小、棕色叶中脉、矮化、抗性,具有重要的育种价值.rla1、rla2表型相似,较初始材料耐密植,在试验各种植密度下,单位面积产量均高于对照组;且产量随着密度增大而提高,其最大密植度在100000株/hm2.遗传学分析显示,rla1、rla2都是单基因隐性突变,而且是等位基因突变.[结论]B73和郑58的EMS突变体库为玉米育种提供了宝贵的材料资源.     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

烟草H2A的序列分析、原核表达载体构建及诱导表达

[目的]对H2A进行序列分析及蛋白结构域分析,并将其克隆入p GEX4T-1原核表达载体进行诱导表达。[方法]以p GADT7-Rec-H2A质粒为模板,通过PCR扩增烟草H2A(3~140 Aa),将其插入原核表达载体p GEX-4T-1中,并将重组载体转入BL21(DE3)中,诱导其表达。[结果]构建了烟草H2A基因全长和p GEX4T-1载体大片段连接的融合表达载体,并成功地诱导其表达。[结论]该研究为运用Pull Down确定Nt Tkr与候选蛋白之间的体外互作进而确定Nt Tkr与蛋白互作的关键结构域奠定了试验基础。