首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到17条相似文献,搜索用时 109 毫秒
1.
孟凡涛  陈芳芳  余为一 《安徽农业科学》2012,40(26):12915-12916
[目的]制备鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)抗原的单克隆抗体。[方法]克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段F306,经杂交瘤技术制备了抗F蛋白的单克隆抗体。[结果]首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以保存的重组质粒为模板,通过PCR扩增获得长度为306 bp的片段,再将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F306。其次经原核表达获得大小为35.8 kD的融合蛋白,提纯后免疫Balb/c小鼠。最后,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代和分泌抗NDV-F的抗体的杂交瘤细胞株。连续传代10次后,细胞上清和腹水的抗体效价仍维持在1∶5 124和1∶64 000以上。[结论]获得了2株稳定分泌抗鸡NDV-F抗体的杂交瘤细胞。  相似文献   

2.
鸡MHCⅡβ链基因的克隆和表达及其抗体制备   总被引:5,自引:0,他引:5  
用自行设计的1对引物,通过RT-PCR从鸡脾细胞中分别克隆了鸡MHCⅡβ链基因片段,大小为798 bp.核苷酸测序结果表明,与已登录的基因序列同源性为95%.将该基因片段插入含谷胱甘肽(GST)基因的质粒pGEX-4T-1,构建了pGEX-4T-1-chMHCⅡβ.经诱导表达,获得分子大小约为53 000的融合蛋白,其中chMHCⅡβ链大小约27 000.经亲和层析,获得纯化GST-β融合蛋白,进一步用此蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗鸡MHCⅡβ链抗体.经过琼扩和ELISA检测,表明该融合蛋白具有良好的抗原性.  相似文献   

3.
为研究NDV-F蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点,作者克隆和表达了NDV-F蛋白基因的部分片段,并检测其免疫反应性.首先根据F基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计了1对引物,以已克隆的NDV(F48E9株)的F基因为模板,通过PCR扩增获得长度为594 bp的片段.接着在电泳和酶切鉴定后将其定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-F594,并经PCR、双酶切及测序鉴定后,进一步将其转化到大肠杆菌BL21中.最后用IPTG诱导表达,提取物用SDS-PAGE和Western-blotting分析.结果表明,该基因片段表达的融合蛋白大小约为46 000,以包涵体形式存在,并具有良好的免疫反应性.  相似文献   

4.
王贤  陈芳芳  余为一 《安徽农业科学》2011,39(20):12223-12224
[目的]研究NDV-HN蛋白抗原表位在动物免疫应答中的作用特点。[方法]根据HN基因和载体pGEX-4T-1的多克隆位点自行设计1对引物,以该实验室保存的重组质粒为模板,进行PCR扩增,再将其所得片段定向插入pGEX-4T-1,构建重组质粒,并对该重组质粒进行鉴定;再将构建的重组质粒在大肠杆菌中表达;最后,鉴定了相应单克隆抗体。[结果]PCR结果表明,得到了与预期结果一致的长度为850 bp的片段;重组质粒鉴定结果表明,成功构建了包含目的基因片段的重组表达质粒pGEX-4T-HN23;重组质粒经原核表达获得大小为57 kD的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠试验表明,用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经ELISA筛选和3次亚克隆获得2株稳定传代(可传20代以上)和分泌抗NDV-HN抗体的杂交瘤细胞株。[结论]获得的鸡新城疫病毒HN单克隆抗体,为进一步研究HN在致病过程的作用及特异性诊断提供了重要试验材料。  相似文献   

5.
新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建   总被引:5,自引:1,他引:4  
应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和一对自行设计的引物,从新城疫病毒(NDV)F48E9株扩增出长度为1664bp的DNA片段。与已报道的NDV-融合蛋白(F)基因比较,两者大小一致。经限制性内切酶反应,获得两个预期大小的片段。将克隆的F基因定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,证明构建的重组质粒含有NDV-F基因。  相似文献   

6.
应用PCR方法克隆了创伤弧菌Vibrio vulnificus FJ03-X2株的铁调基因fur(Ferric uptake regulator),该基因片段大小为450bp,编码149个氨基酸;以pET32a为表达载体,构建了原核表达质粒pET32a-FUR,表达质粒测序结果表明目的基因与GenBank中报道的创伤弧菌fur基因的同源性达98%以上;诱导表达获得可溶性的重组表达蛋白rFUR。镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化rFUR,SDS-PAGE电泳分析其分子量约33kD。以纯化后的融合蛋白rFUR为抗原,4次免疫SD大鼠,制备抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗体。用ELISA方法检测鼠多克隆抗体的效价达到1∶256 000,表明融合蛋白rFUR具有良好的免疫原性。  相似文献   

7.
朱静文  余为一 《安徽农业科学》2011,39(20):12221-12222
[目的]获得研究鸡CD8分子的单克隆抗体。[方法]用自行设计的引物PCR扩增鸡CD8分子α链部分基因片段,构建2个原核重组质粒,该片段经原核表达和纯化后免疫BALb/c小鼠,最后将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,细胞上清液用ELISA检测。[结果]PCR扩增获得大小约为510 bp的基因片段。构建的pET-32a-CD8α导入大肠杆菌,诱导表达获得了大小为39 kD的融合蛋白H is-CD8α。融合细胞经亚克隆,其上清液用ELISA检测和筛选,获得1株稳定传代和分泌抗CD8α的抗体的杂交瘤细胞株。该株细胞被命名为C11。上清液的ELISA抗体效价达1:600。[结论]该研究以原核表达的CD8α为抗原制备了1株单克隆抗体。  相似文献   

8.
[目的]为探究鸟传染性支气管炎病毒(IBV)的感染和复制过程及其防治提供信息和途径。[方法]以鸟IBV的cDNA为模板,利用PCR技术克隆IBV类木瓜蛋白酶基因。将回收片段与pGEX-6p-1载体连接并转入大肠杆菌DH5α中。在IPTG诱导下将克隆的重组质粒在大肠杆菌BL21中进行表达,经纯化获得目标蛋白。[结果]克隆的类木瓜蛋白酶基因全长为924 bp,编码308个氨基酸的完整开放读码框。它与Genbank中IBV M41毒株类木瓜蛋白酶基因的序列完全一致,证实该基因为IBV的类木瓜蛋白酶基因。在IPTG诱导下,BL21菌株成功表达目标基因和GST融合蛋白,融合蛋白约为60 kD。经纯化和酶切后所得蛋白产物的分子量约为34 kD。[结论]该基因的成功克隆和表达为有关蛋白结构与功能的研究奠定了基础。  相似文献   

9.
李文学  李海峰  金清洙 《安徽农业科学》2010,38(16):8462-8465,8483
[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达。[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23,经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆入表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌。通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性。[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008-1.000 mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性。[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础。  相似文献   

10.
[目的]为进一步研究口蹄疫病毒的诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至表达载体pGEX-6p-1中,经测序鉴定目的基因正确地整合至表达质粒中,用IPTG诱导重组基因表达。[结果]通过PCR扩增获得682 bp的目的片段,所克隆的VP1基因在原核细胞中成功表达,表达产物为融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量为51 kD,Western Blot结果表明融合蛋白具有免疫原性。[结论]获得了猪O型口蹄疫VP1融合蛋白,可作为包被抗原用于口蹄疫诊断试剂盒的研制。  相似文献   

11.
[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白(N)基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T.1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31(DE3)感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39.866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10%的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。  相似文献   

12.
[目的]研究鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位(NDV F2-3)的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。  相似文献   

13.
[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。  相似文献   

14.
A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)   总被引:1,自引:0,他引:1  
[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。  相似文献   

15.
将狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因按正确的读码框克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-1中,转化至大肠杆菌Rosetta株,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示,相对分子量约为82 kD,与预期大小一致。Western-blot检测结果表明,融合蛋白能与多克隆阳性血清发生特异性反应。为获取大量ELISA包被用核蛋白,试验还借助SDS-PAGE方法对重组目的基因的表达条件进行了优化,比较了诱导温度、菌密度I、PTG浓度、诱导时间等参数对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件。结果表明:27~32℃,OD5500.3~0.4,IPTG 0.06 mmol/L、诱导至OD550值不再增加时为最佳诱导表达条件。优化后经扫描分析显示,所表达融合蛋白占菌体总蛋白的20%以上。经包涵体纯化和亲和层析纯化,可获得纯度较高的GST融合蛋白。  相似文献   

16.
为了构建Myo5a特异性片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a,采用PCR扩增出Myo5a基因特异性片段的蛋白编码序列,经BamH I和Xho I双酶切后,将片段插入原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组子PGEX-4T-3/Myo5a。最后重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a经鉴定完全正确。  相似文献   

17.
曲宇杰  赵庆臻  卢娇  曹雪松 《安徽农业科学》2011,39(23):13947-13948
[目的]构建大麦黄矮病毒运动蛋白(BYDV-MP)基因的原核表达载体,并在E.coli-BL21中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的大麦黄矮病毒PAV6株系的基因序列设计合成1对引物,应用RT-PCR技术从感染大麦黄矮病毒的叶片中扩增得到大麦黄矮病毒(BYDV)的运动蛋白(MP)基因,利用基因重组技术构建pGEX-4T-1-MP,将其转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21(DE3)中,用IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1-MP在E.coli-BL21中进行表达。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定,鉴定正确后,与GeneBank中收录的大麦黄矮病毒PAV6株系的MP基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下,高效表达出相对分子质量约43 kD的蛋白,蛋白质电泳(SDS-PAGE)结果表明,表达的蛋白条带与预期的GST-MP融合蛋白相符。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-MP的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了MP,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号