谢瓦氏曲霉间型变种veA基因全长克隆及序列分析

为进一步研究谢瓦氏曲霉间型变种中veA基因的结构及其与有性发育的关系,以谢瓦氏曲霉间型变种为有性发育研究材料对veA基因进行全长克隆,根据已克隆到的veA保守区片段设计基因特异性引物(GSP),使用RACE技术从总RNA克隆到了长度为2 515 bp的veA基因的cDNA。序列分析表明,该cDNA编码有562个氨基酸残基,其预测蛋白质序列与丝状真菌的其他种相应预测蛋白质比对结果发现,其相似性较好,保守区序列集中于蛋白质的N端。进一步研究表明,该基因开放阅读框内只含一个内含子,长度为54 bp,位于起始密码子下游149 bp处。说明,已成功地从谢瓦氏曲霉间型变种中克隆到了veA基因。     

谢瓦氏曲霉间型变种flbA基因cDNA的全长克隆及序列分析

为进一步研究谢瓦氏曲霉间型变种中flbA基因的结构及其与有性发育的关系,根据FlbA氨基酸的保守序列设计简并引物,利用RT-PCR、RACE方法从谢瓦氏曲霉间型变种的总RNA中扩增出flbA基因的cDNA序列。该序列全长3060 bp,包含2295bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),预测编码一个由764个氨基酸组成的蛋白,该蛋白分子量为83 181.19,理论等电点为6.31,为不稳定的亲水蛋白。序列同源性为:该基因与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的发育调控子flbA相似度,最高为77%,其编码的氨基酸含有一个RGS(Regulator of G protein Singaling)和两个DEP(dishevelled,Egl-10,pleckstrin)保守域,与Aspergillus其他种的FlbA蛋白保守域一致。     

谢瓦氏曲霉间型变种nsdD基因全长克隆及序列分析

为研究谢瓦氏曲霉间型变种中nsdD基因的结构及其与有性产孢的关系,根据同源克隆及染色体步移技术克隆nsdD的全基因序列,并进行生物信息学分析。结果表明:该序列基因全长为1 773bp,开放阅读框长度为1 293bp,编码430个氨基酸,分子质量为46.659 4KD,理论等电点为9.08。序列同源性分析该基因与土曲霉(Aspergillus terreus)nsdD基因相似度最高为69%,含有1个GATA型锌指保守结构域,与其他曲霉的nsdD蛋白保守域相符。     

高产红曲色素低产桔霉素紫色红曲霉转化子筛选与代谢产物分析

以红曲米中筛选到的紫色红曲霉Mp-41菌株为出发菌株,利用农杆菌介导T-DNA插入转化技术,构建了含有983株红曲霉转化子的T-DNA插入转化子库。用紫外-可见光扫描方法等从转化子库中筛选出10株红曲色素色价稳定高于原始Mp-41菌株的转化子,薄层层析结合高效液相色谱(HPLC)技术分析了10株转化子发酵液中桔霉素的含量;其中,转化子62的红曲色素色价较高,为95.4 U/m L,是原始Mp-41菌株(色素色价50.7 U/m L)的1.88倍,桔霉素含量稳定低于原始Mp-41菌株。以原始Mp-41菌株和转化子62为试验材料,进行5 L发酵罐发酵并定时取样,HPLC等方法分析生长量和发酵液中各种代谢产物的含量。结果显示,转化子62生长速度稍快于原始Mp-41菌株,红曲色素色价和莫纳可林K的含量分别为120.76 U/m L,63.72 mg/L,是原始Mp-41菌株的1.5倍和1.21倍;而桔霉素含量为1.172 4 mg/L,是原始Mp-41菌株的35.08%。因此,利用T-DNA插入的方法对红曲霉进行育种,能产生稳定的遗传变化,在红曲霉资源的利用上有一定潜力。     

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

为了构建限制性内切酶介导的整合(REMI)技术介导的红曲霉(Monascus anka)遗传转化系统,以潮霉素B作为抗性筛选标记,pBC-Hygro、pCB1003、pAN7-1作为转化质粒,采用REMI技术转化红曲霉.结果表明,用REMI技术介导红曲霉转化时,质粒pBC-Hygro和pCB1003适合于红曲霉的转化.环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别;在用REMI技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化;原生质体浓度为1×107～1×108个/mL时,每微克质粒可获得的潮霉素B抗性转化子为2 800～3 200个;HindⅢ介导转化时的最佳酶用量为105～120 U;在质粒用量为8μg/100 μL时转化率最高.     

根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统的构建

[目的]建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统,探讨利用泡盛曲霉表达异源蛋白的可行性。[方法]从国内主要菌种库中购买泡盛曲霉菌株,根据分泌蛋白图谱分析确定合适的宿主菌,在此基础上通过药物敏感性分析确定遗传转化的选择标记,并利用构建的泡盛曲霉遗传转化体系对米黑根毛霉脂肪酶基因RML进行转化、表达研究,通过转化子鉴定及性质分析考察泡盛曲霉作为异源蛋白表达系统的可行性。[结果]通过分泌蛋白图谱分析确定泡盛曲霉CBS115.52和CICC2257作为异源蛋白表达的宿主菌;药物敏感性试验确定潮霉素抗性基因(HygBr)作为有效的遗传选择标记;在此基础上,利用根癌农杆菌介导的转化方法(agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT),将带有HygBr的质粒pHGW-amdS成功导入泡盛曲霉宿主菌CBS115.52,建立以HygBr为选择标记的泡盛曲霉遗传转化体系。利用该体系,介导米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)的表达载体转化泡盛曲霉,通过底物水解试验、SDS-PAGE及Western blot确定RML基因已在泡盛曲霉中表达。[结论]该研究证明了根癌农杆菌介导转化泡盛曲霉作为异源蛋白的表达体系具有潜在的可行性。     

菌物生物技术：外源蛋白在米曲霉中的表达及分泌

米曲霉是与工业用酶及食品发酵相关的重要微生物,其分泌蛋白的能力有望将其用于外源蛋白表达的遗传工程研究。为了构建米曲霉的转化系统,首先由紫外照射,分离获argB^-突变株,再通过CaCl2调节的化学方法和电穿孔技术将携带构巢曲霉argB基因的质粒导入米曲酶受体细胞,经筛选获得多拷贝及遗传稳定的转化子,转化频率为10～50转化子/ug DNA。虽然构巢曲霉与米曲霉argB基因的同源性不高,但前者对后者argB^-突变能起到补偿作用。在电场调节的转化中--电穿孔,适宜条件为6.3kV/cm和1540ohm。电场中,原生质体相对于非原生质体在1.3kV/cm条件成活率为80%,而6.3kV/cm下为50%。为了实现外源基因在米曲霉中的表达,天然植物源的蜜饯--奇甜蛋白基因及构巢曲霉中作为营养选择标记的argB通过共转化被引入受体细胞中,然后从培养基中获得与纯化的奇甜蛋白相似的具免疫活性的22kDa分子量的蛋白质,这说明植物中的信号序列同样可在米曲霉中起作用,调节奇甜蛋白分泌到细胞外。     

根癌农杆菌介导火龙果溃疡病菌遗传转化体系的构建及转化子筛选

为了探究火龙果溃疡病病原菌的致病机理,笔者利用农杆菌介导的遗传转化技术,分析了根癌农杆菌浓度、分生孢子萌发时间以及共培养温度等3个主要因素对遗传转化效率的影响,建立火龙果溃疡病菌的遗传转化技术体系,并对转化子进行筛选。结果表明,当农杆菌浓度OD₆₀₀=0.5、分生孢子萌发时间24 h、共培养温度25 ℃时遗传转化效率最高（833个转化子/106分生孢子）;随机挑选200个转化子进行筛选,获得3株菌落形态与野生型菌株差异较大的转化子,4株产孢量减少的转化子,5株产孢量增加的转化子,6株致病力下降的转化子。     

根癌土壤杆菌介导棒形青霉的遗传转化

为实验室棒形青霉的功能基因研究奠定基础,采用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化方法,以棒形青霉的分生孢子为受体,p DHt-sk-hyg为双元载体,成功实现棒形青霉的遗传转化。结果表明:棒形青霉对潮霉素B比较敏感,30μg/m L就可以抑制其生长;遗传转化的效率为70~90个转化子/106个分生孢子,连续转接5代能够稳定遗传;转化子的PCR检测表明,潮霉素磷酸转移酶标记基因已整合到棒形青霉的基因组中,转化子的遗传表现稳定。     

根癌农杆菌介导的香蕉炭疽菌转化

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,以香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)的分生孢子为受体,pTHPR1为双元载体,成功实现了植物病原真菌香蕉炭疽菌的遗传转化.在诱导培养基pH 5.6、乙酰丁香酮200 μg/mL、共培养时间24 h等适宜条件下,最高转化率可达260个转化子/106个孢子.对转化子的PCR检测表明,T-DNA已整合到香蕉炭疽菌的基因组中,转化子的遗传表现稳定.