锌指核酸酶技术在基因治疗中的应用研究进展

锌指核酸酶技术是一种新兴的基因高效靶向修饰和调控技术,目前该技术已在人类疾病的基因治疗中得到应用,通过敲除致病基因使其丧失致病性或者通过修复突变基因使基因表达正常,实现了对多种人类疾病的基因治疗。基于提高锌指核酸酶效率、特异性和降低细胞毒性等方面的研究较少的现状,特就人工锌指核酸酶介导的基因敲除和基因同源重组修复等在人类疾病基因治疗方面的应用及存在问题进行了综述,并对相关研究的开展进行了展望。     

CRISPR/Cas9技术及其应用于基因敲除研究进展

CRISPR/Cas9是一种高效率、简单操作、低成本的基因编辑工具，近年来广泛应用于动物、植物和微生物基因敲除研究，为深层次地应用于医学研究奠定了基础。概述CRISPR/Cas9技术在动物、植物和微生物的基因敲除中的研究进展，并对其深入研究进行展望。     

广州：世界首例内源性基因敲除猪诞生

近日，从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院研究员赖良学研究团队与美国密歇根大学心血管研究中心陈育庆团队合作，首次将锌指核酸酶基因打靶技术应用于猪内源性基因敲除研究，成功敲除了猪内源性PPARγ基因。这项研究在世界上首次建立了PPARγ基因敲除猪模型，对糖尿病和心血管并发症的研究有重要应用价值。     

CRISPR/Cas9技术在昆虫基因功能研究中的应用及优化

主要概述了CRISPR/Cas9技术应用于涉及鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目、直翅目和双翅目的昆虫在色素沉着、抗性、嗅觉、交配和性别发生等方面的研究进展，包括基因敲除和基因敲入技术的应用，同时总结了目前CRISPR/Cas9系统的优化方案，最后对改良CRISPR/Cas9系统在昆虫基因组学研究和农业害虫防控的应用前景进行了展望。利用基因编辑技术对昆虫基因功能进行探究是除基因过表达、RNA干扰等方法外的一种有效策略。CRISPR/Cas9技术是近年来出现并迅速发展的第三代基因编辑工具，以操作简便、成本低和编辑效率高等优点而被广泛应用于生物科学中的各个分支。     

苹果树腐烂病菌高效基因敲除受体菌株ΔVmKu80的构建

为验证苹果树腐烂病菌VmKu80的基因功能,构建高效率基因敲除的受体菌株。通过基因敲除技术获得介导非同源末端连接(NHEJ)途径的VmKu80基因缺失突变体,并对其生长速率、皿内菌落形态、致病力、分生孢子器的形成和基因敲除效率等进行分析。结果表明,该突变体的生长速率、皿内菌落形态、对苹果的致病力和分生孢子器产生等均与03-8菌株无显著差异,且以VmKu80缺失突变体为受体菌株的基因敲除效率是03-8菌株的12倍。说明,VmKu80缺失突变体的获得可以实现苹果树腐烂病菌基因敲除工作的高通量化,有助于苹果树腐烂病菌的基因功能研究。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于绿僵菌

近年来的研究显示,CRISPR/Cas9系统是强有力的基因编辑新技术.以蝗绿僵菌为试验对象,以同源重组敲除系统为对照,研究CRISPR/Cas9系统敲除蝗绿僵菌的基因isp4核苷酸序列.阐明了CRISPR/Cas9载体构建的方法,比较了CRISPR/Cas9和Recombinase敲除技术的异同,最后通过PCR和突变菌株的表型验证了CRISPR/Cas9系统能够应用于绿僵菌.结果表明,CRISPR/Cas9在昆虫病原真菌绿僵菌中是有效的基因编辑技术.     

靶除内蒙古白绒山羊FGF5基因对其毛被性状的影响

本研究以内蒙古自治区生物制造重点实验室应用基因打靶技术和TALEN技术获得的靶除FGF5基因的内蒙古白绒山羊为材料,通过对其进行绒毛指标测定,探讨了基因打靶技术和TALEN技术靶除FGF5基因对绒山羊绒毛性状的影响,并在国内外首次将模糊数学的模糊综合评价方法运用于两种基因编辑技术的评价。结果表明与对照白绒山羊相比,基因打靶技术获得靶除FGF5基因绒山羊的绒长度明显降低、细度明显变粗和毛长度明显增加;TALEN技术获得靶除FGF5基因绒山羊的绒长度明显增加。模糊综合评价结果说明在2只不同敲除技术的绒山羊个体中,应用TALEN技术敲除的绒山羊和基因打靶技术敲除的绒山羊在毛被性能改善方面是有差异的。     

基因编辑新技术研究进展

基因编辑是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术,目前主要有人工核酸酶介导的锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)技术和RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶(CRISPR-Cas RGNs)技术。它们都能特异性地识别靶位点,对其单链或双链进行精准切割后,由细胞内源性的修复机制来完成对靶标基因的敲除和替换。本文比较了这3种基因编辑技术,并对其应用进展做了介绍。     

对CRISPR-Cas系统的简单介绍

基因敲除是一种遗传工程基因修饰技术,针对某个感兴趣的遗传基因,通过一定的基因改造过程,令特定的基因功能丧失,并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响,进而推测该基因的生物学功能的一种技术手段。CRISPR的全称为成簇的、规律间隔的短回文重复序列。CRISPR-Cas系统可用于基因敲除和敲入。本文主要从其结构、工作原理、在定点修饰中的应用及研究进展等各个方面来介绍CRISPR/Cas9系统。     

Ⅱ型内含子介导的基因打靶技术及应用前景

Ⅱ型内含子除具有核酶的特性之外，还可作为一种可移动的元件特异性地转移到基因组序列中，其转移过程需要内含子RNA和内含子编码蛋白质（IEP）来识别靶标位点，内含子已经作为一种新型的基因打靶工具应用于原核生物的基因插入失活和特定的基因敲除，并在真核生物基因组的功能基因组学和基因治疗中展现了广阔的应用前景。     

运用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼前肾表达基因的敲除研究

CRISPR/Cas9是目前最热门的基因编辑技术,是进行基因敲除的有效手段.斑马鱼是一种常用的研究脊椎动物器官发育的模式生物,本实验选取10个斑马鱼前肾表达基因atp1a1a1,atp1a1a.2,atp1a1a.3,atp1a1a.4,atp1a1a.5,pkd2,aqp3a,bmper,isl2a和tbx2a,运用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除以研究肾脏发育.经过三代筛选,每个基因获得了至少一种移码突变.突变体的初步表型分析显示,10个基因中只有atp1a1a.2和pkd2基因突变可以导致斑马鱼胚胎发育缺陷,隐性致死,这与已经报道的突变体或基因敲降结果类似.上述结果表明CRISPR/Cas9基因编辑技术可在斑马鱼中高效地进行基因敲除,获得的突变体为以后深入研究斑马鱼前肾发育提供了重要材料.     

苏云金芽孢杆菌外孢囊蛋白基因敲除载体的构建

以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki) 8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续...     

甜瓜AMS基因结构分析及基因编辑载体构建

【目的】研究鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)的基因家族，分析CRISPR基因编技术并构建其敲除载体，为甜瓜雄性不育基因AMS功能验证提供依据。【方法】采用生物信息学技术鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)家族基因，分析其进化关系、保守基序及理化性质。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以甜瓜AMS基因外显子区设计gRNA引物，以载体pHSN401为模板，扩增获得sgRNA克隆框，使用Bsa I酶切pHSN401载体，利用DNA重组酶构建重组载体并转化农杆菌，挑选单克隆进行培养，随后进行菌液PCR鉴定。【结果】甜瓜AMS基因编码的蛋白质长度从501～605 aa不等，平均分子量约为59 351 Da,等电点为5.04～6.45,甜瓜大部分AMS基因定位在细胞核；利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在AMS基因的CDS区设计3个靶位点，分别是AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。【结论】AMS基因主要被预测在细胞核中表达，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建...     

苏云金芽孢杆菌NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的克隆和敲除载体的构建

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.     

慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因敲除

【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列（KY235336）特点,分别在其5'和3'端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sgRNA的打靶质粒,筛选出在5'和3'端打靶效率较高的sgRNA。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对ev21基因进行剪切,并通过同源重组方式以红色荧光蛋白（mCherry）的DNA片段（CAG-mCherry）替换ev21基因,实现对慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因定点敲除。【结果】在慢羽鸡成纤维细胞中能检测到ev21基因,构建的4种sgRNA（sgRNA1~sgRNA4）均能成功插入对应的打靶质粒中,经嘌呤霉素筛选及T7E1酶切检测,发现转染4种不同sgRNA打靶质粒后慢羽鸡成纤维细胞均有不同程度的死亡,其中又以sgRNA1和sgRNA3的基因敲除效率较高。同时针对同源位点左右同源臂构建表达mCherry的供体质粒,以其转染293T细胞12 h后均能表达出mCherry。以sgRNA1和sgRNA3打靶质粒及供体质粒共同转染慢羽鸡成纤维细胞,观察发现成纤维细胞内的mCherry持续表达,至转染后第30 d通过流式细胞仪分选收集红色荧光阳性成纤维细胞,并提取其总DNA进行PCR鉴定与基因测序,结果显示红色荧光阳性成纤维细胞中有目的片段（CAG-mCherry）插入,即以插入替换方式能实现对ev21基因的敲除。【结论】基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲除方法能成功敲除慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因,为培育缺失ev21基因的慢羽鸡品系提供技术支持。     

基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响

【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。     

通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株

【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能,构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法,构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段（Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌,通过同源区段的重组,潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80,从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型,即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80作为受体菌株,采用上述基因敲除方法测试2个几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株ΔVdku80在PDA培养基上的菌落形态相似,且培养8 d后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80产孢高峰均出现在摇瓶培养后第5天,且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为0.02%的MMS对野生型和突变体菌株ΔVdku80的生长均有明显的抑制作用,且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4周后,棉株真叶均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状,野生型和突变体菌株ΔVdku80对棉花造成的病情指数分别为54.2±4.9和53.6±5.4,亦无明显变化。因此,突变体菌株ΔVdku80的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为44%和31%;而使用ΔVdku80作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作为受体菌株可以提高其他基因的基因敲除效率,且Vdku80的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响,因此不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。     

基于CRISPR/Cas9技术建立IGF2R基因修饰PK-15细胞

作为我国特色的地方种质资源,藏猪对高海拔、低氧、强紫外线辐射等恶劣环境具有良好的适应性,前期研究发现藏猪的IGF2R（insulin-like growth factor 2 receptor,IGF2R）基因在其内含子上有1段274 bp的缺失,且该缺失为藏猪独有的变异,关于IGF2R是否参与藏猪对低氧等恶劣环境的适应性调节的相关研究尚未报道。为了建立IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,研究IGF2R基因对藏猪低氧耐受特性的影响,通过CRISPR/Cas9技术建立基因修饰PK-15细胞系,并通过PCR、实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR,RT-qPCR）、蛋白免疫印迹（Western-blot）、免疫荧光（immunofluorescence,IF）等方法鉴定其分子特征,随后分别利用CCK-8和RT-qPCR 、Western-blot对基因修饰细胞进行活力和凋亡基因检测。结果显示,已成功构建IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,IGF2R基因表达量极显著下调（P < 0.01）。基因修饰细胞活力在72 h时极显著上升（P < 0.01）,并且含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase9）和BCL-2关联 X （BCL2-associated X,BAX） 蛋白的水平显著下调（P < 0.05）,并且B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL2）基因的mRNA水平极显著上升（P < 0.01）。成功构建了IGF2R基因精确修饰的PK-15细胞系,并初步进行了功能研究,为研究IGF2R基因功能提供细胞模型,并为后续基因编辑猪的制备奠定基础。