开花期水稻颖花实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择

实时定量RT-PCR (qRT-PCR)技术现已发展成为基因表达分析的首选方法,然而为了得到精确和可靠的qRT-PCR分析结果,需要应用稳定表达的内参基因对样品进行校正.以粳稻‘武运粳7号’和籼稻‘明恢63’的颖花为试验材料,应用geNorm算法对6个常用的内参基因(ACT1、eEF1-oα、β-TUB、UBQ5、GAPDH和UBC)在颖花开放过程中的表达稳定性进行分析.结果发现:eEF1-α和β-TUB在‘武运粳7号’颖花样品中的表达最为稳定,UBC和GAPDH在‘明恢63’颖花样品中的表达最为稳定,而ACT1在2个品种的颖花样品中表达均最不稳定.此外,同时选取2个最稳定表达的内参基因作内参照可获得更精确的校准.分析不同内参基因对JA生物合成关键基因OsAOC表达定量的影响.OsAOC表达的相对定量会随所选内参基因的不同而发生变异,进一步强调选择合适的内参基因进行校准是获得可靠qRT-PCR结果的重要前提.     

猪睾丸组织定量PCR分析中内参基因的选择

【目的】采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对基因表达进行分析时,选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中,表达稳定的蛋白编码内参基因和micro RNA(miRNA)内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因,为准确定量不同时期猪睾丸组织中目的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用8个不同发育时期(E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM)的猪睾丸组织为材料,采用Trizol裂解法提取各样品的总RNA,利用Nan Drop ND-2000分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。设计并合成已报道的猪其他组织中表达相对稳定的5个编码内参基因(GAPDH、TBP、β-actin、SDHA和B2M)以及5个miRNA内参基因(U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103)的特异性引物序列,逆转录得到cDNA模板后,按1:10梯度稀释为7个浓度梯度进行qRT-PCR反应以构建标准曲线。并对10个候选内参基因在各时期睾丸组织中的表达情况进行实时荧光定量全面检测,采用Ge Norm法对定量结果进行综合分析,最后根据内参基因稳定性值(M值)的大小筛选出最稳定的参考基因;M值越小,表明内参基因的稳定性越好,反之则越差。【结果】对GAPDH、TBP、β-actin、SDHA、B2M、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10个候选内参基因的熔解曲线进行分析发现,均无非特异扩增及引物二聚体,说明各内参基因特异性良好,qRT-PCR反应的专一性高;以Ct值为纵坐标,相对拷贝数的对数为横坐标进行标准曲线分析可知,各内参基因在系列稀释的浓度梯度内具有良好的线性关系;通过对10个候选内参基因在不同时期猪睾丸组织中的表达稳定性分析发现,蛋白编码基因中,最稳定的为TBP,最不稳定的是GAPDH;miRNA候选内参中,最稳定的为U6,最不稳定的是ssc-miR-26a。【结论】成功筛选出猪睾丸组织基因表达分析中稳定表达的内参基因TBP和U6,可作为猪睾丸组织基因表达研究中最佳内参基因候选者。     

中国小麦花叶病毒(CWMV)侵染条件下小麦内参基因的选择

实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择。为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异性分析,从10个持家基因中选择8个候选基因,然后以接种CWMV的小麦样品为材料,利用qRT-PCR技术进一步检测上述8个基因在CWMV侵染条件下小麦样品中的时空表达特性。基于这些数据,通过geNorm、NormFinder程序分析,结果表明,2个小麦基因(即26S和CDC)在CWMV侵染前后以及不同组织中表达最为稳定,26S和CDC组合可选作CWMV与小麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因。     

内参基因在昆虫qRT-PCR中的研究进展

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有灵敏度高、特异性强等优点,是昆虫目标基因表达和转录分析最常用的技术手段之一。然而,为了消除样本在RNA产量、质量及逆转录效率上存在的差异,在进行qRT-PCR分析目标基因表达量时必须选择合适的"管家基因"作为内参基因。近年来,大量研究表明不同昆虫和不同试验条件选择的内参基因也不尽相同。因此,选择合适的内参基因是正确判断qRT-PCR结果分析的关键。从内参基因的选择、昆虫内参基因的研究和内参基因稳定性评价等几个方面进行综述,以期为研究者在将来的昆虫试验中选择合适的内参基因提供理论参考依据。     

鲜切马铃薯实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

[目的]选择鲜切马铃薯实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析中合适的内参基因。[方法]以受到高温、光照等胁迫的鲜切马铃薯为材料,应用qRT-PCR技术,分析18S rRNA、GAPDH、Actin和EF1a 4个常用内参基因的表达情况。[结果]经GeNorm软件分析发现,当利用qRT-PCR分析比较鲜切马铃薯中的基因表达差异时,可选择Actin作为校正内参基因。[结论]该研究为进一步开展鲜切马铃薯分子生物学研究奠定了方法学基础。     

景宁木兰热胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

高温对景宁木兰Magnolia sinostellata生长产生严重影响。通过筛选景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因,可以为景宁木兰在高温条件下基因表达研究提供准确数据,达到对目的基因进行准确量化的目的。以热胁迫下景宁木兰1年生实生苗的根、茎、叶组织为材料,从转录组数据库中选取13个管家基因ACTIN-7（肌动蛋白基因-7）,CYP（亲环蛋白基因）,EF-1α（延伸因子-1α蛋白基因）,GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）,GTB（GTP结合蛋白基因）,NAC（NAC域蛋白基因）,NADP（异柠檬酸脱氢酶基因）,TEF（翻译延伸因子基因）,UBC（泛素化酶基因）,UBQ（多聚泛素蛋白基因）,α-TUB（α微管蛋白基因）,β-TUB（β微管蛋白基因）和18S（18S核糖体RNA）,通过Primer 5.0进行引物设计,琼脂糖电泳和溶解曲线分析验证引物特异性;利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术和geNorm,NormFinder和BestKeeper等3个内参分析软件研究候选内参基因在热胁迫下不同组织中的表达稳定性,并通过CSLD3和KOR 2个目的基因的表达分析验证其可靠性。13个内参基因的电泳结果均显示单一条带,溶解曲线也均显示单一峰,证明引物特异性良好;13对引物的扩增效率均在100%左右;内参软件综合分析得到,UBC,EF-1α和ACTIN-7是景宁木兰在热胁迫下较为稳定的内参基因,以3个单独的内参基因以及内参组合（EF-1α和ACTIN-7）为参照对CSLD3和KOR的表达模式进行校准,也显示了一致的表达水平。通过qRT-PCR技术和内参软件分析,UBC,EF-1α和ACTIN-7等3个内参基因在景宁木兰热胁迫下不同组织中稳定性较高,CSLD3和KOR等2个目的基因的表达也证实了其可靠性。因此,UBC,EF-1α和ACTIN-7可以作为景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因。     

桂花组织基因表达中荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选桂花Osmanthus fragrans不同组织基因表达分析中适合的内参基因,以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶和1年生茎等5个不同组织为材料,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测7个候选内参基因的表达水平,并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对各候选内参基因的表达稳定性进行评价,最后利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因相对表达水平验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明:综合3个软件的评价排序,确定不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2,而Of18S是最差内参基因。OfCRTISO1基因相对表达水平分析证实,不同组织中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2个表达最稳定的基因组合,即可获得更为精确的基因表达结果。旨在为桂花组织间重要基因的定量表达分析提供科学依据。图 4 表 4 参34     

荷花淹水胁迫下实时定量PCR内参基因的验证

旨在筛选荷花淹水胁迫过程中表达稳定的内参基因,使不同胁迫处理下荷花目标基因的定量更为准确。以不同淹水胁迫时间的荷花叶片为材料,利用实时定量PCR技术验证5个植物常用内参基因,包括18S rRNA(18S)、actin(ACT)、elongation factor 1α(EF1α)、Histone H3(HIS)及β-tubulin(TUB)的表达水平,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对结果进行分析,对其表达稳定性进行评价。将优选的2个内参基因(18S和ACT)应用于荷花转录因子基因ERFB2-1(ethylene responsive factor B2-1)和ERFB2-2的淹水胁迫表达,结果显示表达趋势一致,验证了可靠性。本研究对荷花淹水胁迫过程中关键基因表达的qRT-PCR分析有重要的应用价值。     

赤霞珠葡萄发育后期RT-PCR内参基因的筛选和验证

葡萄果实发育后期基因表达水平的变化对果实品质的形成具有重要影响,选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的首要条件。本试验以赤霞珠葡萄发育后期不同取样时间的果皮为材料,通过qRT-PCR分析了常用候选内参基因β-actin、EF-1α、GAPDH和SAND的表达变化,借助ge Norm、Norm Finder和BestKeeper程序筛选出在葡萄发育后期qRT-PCR分析的理想内参基因。结果表明,β-actin的稳定性最好,其次是SAND,而GAPDH和EF-1α的稳定性相对较低;同时,用筛选的内参基因β-actin和SAND分析葡萄白藜芦醇合成途径中二苯乙烯合酶基因的表达水平,其表达规律一致。说明,β-actin和SAND是研究赤霞珠葡萄发育后期基因表达的理想内参基因。     

朱砂叶螨各发育阶段内参基因评估及筛选

在实时荧光定量PCR试验中需引入一个或几个表达稳定的内参基因作为参照物对表达结果进行校正和标准化处理,但并非所有内参基因都完美地适用于任何特定试验条件下的生物样本,要得到准确、真实的定量结果,就需要筛选与试验匹配的最佳内参基因。研究通过实时荧光定量技术,利用geNorm软件分析,对朱砂叶螨敏感品系及抗炔螨特品系各个发育阶段中6个常用内参基因的表达稳定性进行评估。结果表明,两个品系间RPS18与α-TUB内参基因组合表达稳定度较高;不同发育阶段α-TUB与GAPDH内参基因组合表达稳定度较高。     

Identification of suitable reference genes in leaves and roots of rapeseed(Brassica napus L.)under different nutrient deficiencies

Nutrient deficiency stresses often occur simultaneously in soil. Thus,it's necessary to investigate the mechanisms underlying plant responses to multiple stresses through identification of some key stress-responsive genes. Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)is essential for detecting the expression of the interested genes,of which the selection of suitable reference genes is a crucial step before qRT-PCR. To date,reliable reference genes to normalize qRT-PCR data under different nutrient deficiencies have not been reported in plants. In this study,expression of ten candidate reference genes was detected in leaves and roots of rapeseed(Brassica napus L.)after implementing different nutrient deficiencies for 14 days. These candidate genes,included two traditionally used reference genes and eight genes selected from an RNASeqdataset. Two software packages(Ge Norm,Norm Finder)were employed to evaluate candidate gene stability. Results showed that VHA-E1 was the highest-ranked gene in leaves of nutrient-deficient rapeseed,while VHA-G1 and UBC21 were most stable in nutrient-deficient roots. When rapeseed leaves and roots were combined,UBC21,HTB1,VHA-G1 and ACT7 were most stable among all samples. To evaluate the stabilities of the highest-ranked genes,the relative expression of two target genes,Bn Trx1;1 and Bn Pht1;3 were further determined. The results showed that the relative expression of Bn Trx1;1 depended on reference gene selection,suggesting that it's necessary to evaluate the stability of reference gene prior to qRT-PCR. This study provides suitable reference genes for gene expression analysis of rapeseed responses to different nutrient deficiencies,which is essential for elucidation of mechanisms underlying rapeseed responses to multiple nutrient deficiency stresses.     

磷胁迫下羊草的响应及磷响应相关基因表达分析

【目的】磷是植物生长发育所必需的大量营养元素,研究无机磷酸盐（inorganic phosphate,Pi）胁迫下羊草的响应,筛选不同浓度Pi胁迫下的内参基因,并分析Pi响应相关基因的表达,为羊草Pi胁迫响应的分子机制研究提供基础数据。【方法】以羊草幼苗为材料,进行不同浓度Pi处理培养,对羊草的株高和根长进行检测,利用钒钼黄比色法检测羊草植株中Pi的含量。根据羊草转录组数据选取7个候选内参基因,从NCBI核酸序列数据库选取1个候选内参基因,对羊草不同处理材料进行总RNA提取和cDNA合成,利用qRT-PCR对候选内参基因的表达进行检测,并通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对其稳定性进行评估。根据筛选获得的较稳定内参基因,对Pi响应基因的qRT-PCR检测数据进行相对定量分析。【结果】表型观测结果显示,无论是低Pi还是高Pi胁迫都使得羊草的生长减缓;株高对低Pi或缺Pi胁迫较为敏感,根长对高Pi胁迫较为敏感;并随着处理浓度的增加羊草中Pi的含量也增加。qRT-PCR溶解曲线分析显示8个候选内参基因均具有单一的溶解峰,基因表达谱分析表明8个候选内参基因的CT值范围是17.16—26.61,其中,LcGAPDH的表达丰度最高为17.16—20.22,Lc18SrRNA的表达丰度最低为23.28—26.61,CT值变异系数最小的为LcARPT（2.09%）,最大的为LcTUA（6.8%）。综合geNorm、NormFinder和Bestkeeper稳定性排名,通过计算几何平均数,获得8个候选内参基因综合稳定性排名,其中排名靠前的3个基因分别为Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α,排名最后的2个基因为LcTUA和LcTUB。分别以Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α作为内参基因,qRT-PCR相对定量表达分析结果显示,与对照相比,LcPHO1-2的表达受低Pi或者缺Pi诱导;LcPAP2的表达受高Pi诱导;而LcPAP27的表达同时受低Pi和高Pi下调。【结论】低Pi和高Pi胁迫均使羊草生长受阻,羊草地上组织与地下组织对Pi胁迫响应的模式不同。筛选出3个表达较为稳定的内参基因Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α。LcPHO1-2和LcPAP2分别参与了羊草对低Pi和高Pi的应答响应,LcPAP27同时参与了羊草对低Pi和高Pi的响应进程。     

多花水仙HMGS基因的克隆

以多花水仙花瓣抑制消减杂交文库获得的羟甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS）基因片段为基础,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术从黄花水仙2号和金盏银台中各克隆一条HMGS基因,两基因均含有一个1413bp的开放阅读框,编码470个氨基酸,但存在2个氨基酸差异．氨基酸序列分析表明：黄花水仙2号与葡萄、大豆、蓖麻和玉米HMGS基因的氨基酸相似系数分别为83％、82％、82％和81％．以水仙Actin基因为内参基因,采用荧光定量PCR方法分析HMGS基因在两品种的表达水平,结果表明：两品种HMGS基因的表达水平差异并不明显．     

竹林金针虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选与应用

  目的   筛选平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染条件下筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis幼虫稳定表达的内参基因,为该竹林金针虫相关基因的表达研究奠定基础。   方法   基于筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组数据,利用实时荧光定量PCR扩增特异性引物,分析相关性和扩增效率;利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估筛选出6个候选内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS3、RPS27a),并验证其表达稳定性。   结果   GeNorm分析结果显示:PRS27a和RPS3的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPL13α、β-actin和GAPDH;最适合的内参基因数目为2。NormFinder分析结果显示:RPL13α的表达最稳定,随后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a、β-actin和GAPDH。BestKeeper分析结果显示:β-actin和GAPDH的P＞0.5,不适合作为本试验条件下的内参基因。不同软件分析得出的候选内参排序存在一定差异。综合分析和表达稳定性验证表明PRS27a或RPS3是最佳内参基因,6个目的基因的表达水平变化趋势均基本一致。   结论   PRS27a和RPS3是研究平沙绿僵菌侵染的竹林金针虫相关基因表达的最佳内参基因。图3表3参27     

二斑叶螨内参基因的筛选及解毒酶基因的表达水平

【目的】筛选二斑叶螨（Tetranychus urticae）敏感（SS）和抗甲氰菊酯品系（Fe-R）中合适的内参基因,并通过基因相对表达定量PCR研究二斑叶螨抗性品系解毒酶基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,RT-qPCR）技术,分析二斑叶螨5.8S rRNA、α-tubulin、β-actin、ELF、GAPDH、RPL13a、SDHA和TBP共8个候选内参基因mRNA表达水平的稳定性,并分析二斑叶螨酯酶（Carboxyl/cholinesterases,CCEs）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione s-transferase,GSTs）及细胞色素P450单加氧酶（Cytocheome P450 monooxygenases,P450s）等主要解毒酶基因相对表达量。用GeNorm和NormFinder软件进行内参基因稳定性评估,通过比较Ct值的方法进行基因相对表达量计算。【结果】8个内参基因中稳定性最高的为α-tubulin;以α-tubulin为内参基因,二斑叶螨Fe-R品系GSTs 基因TuGSTo1、TuGSTd1及P450s 基因CYP3D2相对表达量均显著高于SS品系,而CCEs 基因TuCCE1的表达量有所降低。【结论】在二斑叶螨SS和Fe-R品系中α-tubulin为理想的内参基因,RT-qPCR研究表明TuGSTo1、TuGSTd1和CYP3D2相对表达量的升高可能是二斑叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的分子机理。