野油菜黄单胞菌葡萄糖激酶基因的克隆与表达

葡萄糖激酶催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸,是糖酵解的第一步反应,在野油菜黄单胞菌(Xcc)利用碳源代谢及其致病性中起重要作用.为了初步鉴定Xcc葡萄糖激酶基因功能,为研究其利用碳源相关代谢及致病性提供理论依据,以pQE30为表达载体,采用常规PCR技术对野油菜黄单胞菌Xcc8004基因组上注释为葡萄糖激酶的3个基因(XC_1166、XC_1223和XC_1976)进行了克隆与表达,该3个基因在大肠杆菌JM109中有较高表达量,经Ni2+金属层析柱纯化后分别得到带有3个His的融合蛋白XC_1166-His6、XC_1223-His6和XC_1976-His6,分析表明仅XC_1976的表达产物具有葡萄糖激酶活性,为Xcc8004葡萄糖激酶基因,经测定XC_1976-His6的最适反应温度为45℃,最适pH值为7.1,最适反应条件下比活力为(380.6±1.123) U/mg.     

(-)-羟基柠檬酸调控鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的机制

[目的]本文旨在研究(-)-羟基柠檬酸[(-)-HCA]对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的影响及其机制。[方法]选用含(-)-HCA的培养液孵育鸡胚原代肝细胞后,油红染色法检测鸡胚原代肝细胞中脂滴的数量和总面积;试剂盒法检测鸡胚原代肝细胞中甘油三酯、葡萄糖含量及糖代谢、呼吸链关键酶活性。[结果](-)-HCA处理显著降低鸡胚原代肝细胞中甘油三酯含量、脂滴数量和总面积,但对细胞活力和死亡率无显著影响。(-)-HCA处理提高了鸡胚原代肝细胞中葡萄糖消耗量,显著降低了柠檬酸裂解酶活性和细胞质中乙酰辅酶A含量。(-)-HCA处理显著提高了鸡胚原代肝细胞中葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶(E1)、乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶、NADH脱氢酶和ATP合酶活性。[结论](-)-HCA通过抑制柠檬酸裂解酶的活性减少细胞质中乙酰辅酶A的供给,并通过增强糖代谢和呼吸链中关键酶活性而加速能量代谢,最终抑制了鸡胚原代肝细胞中脂滴的沉积。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖酸操纵子突变株的构建

葡萄糖激酶为核黄素的生物合成原料GTP和5-磷酸核酮糖合成的关键酶,为了提高葡萄糖激酶的表达,构建了整合表达载体pRKS - 14,通过同源重组的方法将线性化的pRKS - 14转化枯草芽孢杆菌GJ05,得到GJ06,在葡萄糖酸操纵子基因gntR和gntK基因之间引入了强启动子PB14,为进一步提高核黄素的产量提供原料保障.     

奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢的变化

为确定奶牛乳腺发育与泌乳各时期能量代谢状况及建立生物调控技术,应用试剂盒及高效液相色谱法(HPLC),对奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢重要指标进行了测定。结果表明,己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、甘油三酯、葡萄糖、乳糖、β-酪蛋白、ATP酶、能荷值和NADPH等指标在不同时期都存在差异,即青春期14个月时的葡萄糖浓度最高,妊娠4个月时的NADPH含量最高,围产前期时的甘油三酯含量、乳糖含量和能荷值最高,泌乳7 d时异柠檬酸脱氢酶活性和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性最高,泌乳140 d时的Ca2+Mg2+-ATP酶的活性最高,泌乳280 d时的Na+K+-ATP酶活性最高,退化期3 d的β-酪蛋白含量最高,退化期30 d时的己糖激酶活性最高。揭示了奶牛乳腺发育与泌乳过程中能量代谢的变化规律。     

大肠杆菌Ⅱ型丙酮酸激酶的表达· 纯化及鉴定

[目的]获得大肠杆菌的Ⅱ型丙酮酸激酶。[方法]首先用MEGA7软件对不同生物丙酮酸激酶的编码基因进行聚类分析;通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了大肠杆菌的Ⅱ型丙酮酸激酶基因pykA,将其克隆到pET_28a载体中,构建了重组质粒载体pET_28a-pyk A并在大肠杆菌BL21中实现了Ⅱ型丙酮酸激酶(PykA)的高效表达;利用镍柱亲和层析系统纯化了PykA蛋白,并进行了高效液相色谱(HPLC)检测。[结果]聚类分析结果表明,大肠杆菌Ⅱ型丙酮酸激酶与其他原核生物的丙酮酸激酶氨基酸序列具有高度同源性。HPLC检测发现Ⅱ型丙酮酸激酶Pyk A在体外可以高效地将ADP转化为ATP。[结论]该研究获得了Ⅱ型丙酮酸激酶,为ATP的合成以及Ⅱ型丙酮酸激酶为基础的ATP再生系统的研究提供了参考。     

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶研究进展

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)是植物和细菌中淀粉和糖原合成的限速酶,该酶催化l-磷酸葡萄糖(G-1-P)与三磷酸腺苷(ATP)反应形成腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG).有关该酶的定位、功能、酶学特性、分子生物学已经进行了较为深入和系统的综述.     

优化的ATP生物发光法快速检测面粉中细菌总数

[目的]建立一种快速检测面粉中细菌总数的方法。[方法]采用优化的ATP生物发光法检测面粉中的细菌总数,考察D-荧光素（Ln）浓度、萤火虫荧光素酶（FL）浓度、Mg2＋浓度对生物发光反应的影响。[结果]Ln浓度为70 mg/L,FL浓度为50 mg/L,Mg2＋浓度为0.250 0 mmol/L时,ATP生物发光法的测定结果较理想。该法最低检测细菌总数为1.0×103cfu/ml,与传统的平板计数法具有良好的相关性（P〉0.05）,RSD为4.0%。[结论]优化的ATP生物发光法成本低、操作简便、反应迅速、准确可靠,能快速检测出食品中的细菌总数。     

5'-腺苷磷酰硫酸激酶及其R68K突变体对5'-腺苷一磷酸3'羟基的磷酸化

硫作为生命活动的必需元素,主要以-2价和+6价发挥生物学功能。硫的同化代谢包括胞内活化、转移以及还原等反应。其活化是同化代谢的关键反应,包括ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS)催化硫酸盐与ATP反应生成腺苷-5'-磷酰硫酸(adenosine 5'-phosphosulfate,APS)和焦磷酸(pyrophosphate,PPi)以及腺苷-5'-磷酰硫酸激酶(adenosine 5'-phosphosulfate kinase,APSK)催化APS 3'羟基磷酸化生成3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸(3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate,PAPS),APSK催化APS磷酸机理已经较为清楚。利用APSK对AMP的磷酸化进行了初步分析,发现AMP可作为APSK的底物,反应生成3,5'二磷酸腺苷(3'-phosphoadenosine 5'-phosphate,PAP);对APSK的三维结构进行分析发现,R68同时和APS的磷酸根和硫酸根形成氢键,稳定APS的结合,而K侧链基团比R短2.4魡,R68K突变将导致K不能和距离较远的硫酸根离子相互作用,从而减弱APS的亲和力,而增加与磷酸根离子的相互作用,可能提高AMP的亲和力。研究结果表明,R68K突变体的最适底物变为AMP,KmAMP是对照的0.2倍,而催化效率是对照的5倍。以R68K为偶联酶成功测定了具有较低KmPAP的酵母3,5二磷酸核苷酸酶(3',5'-bisphosphate nucleotidase,YND)动力学常数,为分析测定AMP底物的酶活提供了工具。     

信阳红茶多糖的提取及其对葡萄糖激酶活性的影响

采用简单热水浸提法提取信阳红茶多糖,探讨料液比、提取时间、提取温度等因素对多糖提取率及葡萄糖激酶活性的影响。结果表明:提取红茶多糖的最佳工艺条件为料液比1 g∶25 mL、提取时间6 h、提取温度95℃,该工艺条件下多糖的提取率为3.50%,葡萄糖激酶的相对酶活比值达到3.12。多糖提取率与葡萄糖激酶的相对酶活并不呈正相关关系。     

云南紫薯蓣块根紫色素化学本质和含量的初步研究

通过特征颜色反应、紫外-可见光谱、薄层层析和纸层析初步研究了云南紫薯蓣块根紫色素的化学本质和含量.结果表明:紫薯蓣块根紫色素属于花色苷类;块根皮和肉的色素可能均为飞燕草色素3,5-二葡萄糖苷和矢车菊色素3-(2葡萄糖-葡萄糖鼠李糖苷);皮的色素含量低于肉的,但总黄酮含量高于肉的.研究结果可为紫薯蓣块根紫色性状的机理探索及紫色素的分子结构鉴定提供参考.     

热胁迫对葡萄叶片中蛋白激酶活性的影响

 以葡萄品种京秀（Vitis vinifera L. cv. Jingxiu）一年生扦插苗为试材，40℃高温处理30 min，并以25℃为对照，采用体外底物磷酸化方法对叶片中蛋白激酶的活性进行了测定。结果表明，热胁迫处理后，叶片中蛋白激酶在底物髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)浓度为0.5 mg·ml-1时，其活性达到最大(7 678.7 cpm)，而后随底物浓度的进一步增加，其活性下降。Mg2+浓度为5 mmol·L-1时，蛋白激酶活性达到最大(8 165.8 cpm)。Ca2+对蛋白激酶活性的影响极弱，Mn2+对蛋白激酶活性的激活没有影响。ATP浓度为50 μmol·L-1时，蛋白激酶的活性最大（7 900.9 cpm），比对照高4.7倍。在以组蛋白-Ⅲ（histone-Ⅲ）为底物时，蛋白激酶的活性很微弱，且Mg2+和Ca2+对蛋白激酶有极弱的激活作用。     

吉非替尼靶向治疗非小细胞肺癌的研究

吉非替尼是一种具有抗肿瘤活性的喹唑啉类衍生物,通过竞争抑制ATP与受体区结合,从而抑制酪氨酸激酶活化.吉非替尼主要应用于晚期非小细胞肺癌的二线和三线治疗,其抗肿瘤作用已得到许多研究者的认同.阐述了吉非替尼的药理学、临床研究,吉非替尼疗效的分子预测因素及不良反应的研究成果.     

Structure of the nucleotide activation switch in glycogen phosphorylase a

Adenosine monophosphate is required for the activation of glycogen phosphorylase b and for release of the inhibition of phosphorylase a by glucose. Two molecules of adenosine monophosphate (AMP) bind to symmetry related sites at the subunit interface of the phosphorylase dimer. Adenosine triphosphate (ATP) binds to the same site, but does not promote catalytic activity. The structure of glucose-inhibited phosphorylase a bound to AMP and also of the complex formed with glucose and ATP is described. Crystallographic refinement of these complexes reveals that structural changes are associated with AMP but not ATP binding. The origin of these effects can be traced to different effector binding modes exhibited by AMP and ATP, respectively. The conformational changes associated with AMP binding traverse multiple paths in the enzyme and link the effector and catalytic sites.     

SA与高温交叉处理对葡萄叶片蛋白激酶活性的影响

921.48 cpm,然后随着ATP浓度的增加蛋白激酶的活性不断下降.当反应时间达到10 min时,交叉处理和对照的叶片中蛋白激酶的活性分别达到了最大值9 979.41和7 248.63 cpm,随着时间的增加,蛋白激酶的活性开始迅速下降.     

Ca2+和Mn2+对地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U-32次生代谢及激酶活性的影响

采用Ca2 、Mn2 和地中海拟无枝菌酸菌U 32共培养的方法 ,通过滤纸法检测抗生素含量和离体磷酸化反应检测激酶活性 ,研究Ca2 和Mn2 对地中海拟无枝菌酸菌U 32次生代谢的影响。低浓度Ca2 和Mn2 均能促进地中海拟无枝菌酸菌U 32的生长 ;随着离子浓度增高 ,促生长效果下降 ;浓度太高 ,则表现为抑制作用。 5mmol/LCa2 对地中海拟无枝菌酸菌U 32的色素绝对产量增加效果最好 ,而对其相对于菌体的色素量则以 5mmol/LMn2 的效果最好。 0 5mmol/LCa2 对地中海拟无枝菌酸菌U 32的抗生素合成有很好的作用 ,而Mn2 有一定的抑制作用。对地中海拟无枝菌酸菌U 32的无细胞提取液进行离体磷酸化反应检测 ,发现Ca2 能促进其激酶的活性 ,而Mn2 则相对抑制了某些激酶活性。     

Protein kinase activity closely associated with a reconstituted calcium-activated potassium channel.

Modulation of the activity of potassium and other ion channels is an essential feature of nervous system function. The open probability of a large conductance Ca(2+)-activated K+ channel from rat brain, incorporated into planar lipid bilayers, is increased by the addition of adenosine triphosphate (ATP) to the cytoplasmic side of the channel. This modulation takes place without the addition of protein kinase, requires Mg2+, and is mimicked by an ATP analog that serves as a substrate for protein kinases but not by a nonhydrolyzable ATP analog. Addition of protein phosphatase 1 reverses the modulation by MgATP. Thus, there may be an endogenous protein kinase activity firmly associated with this K+ channel. Some ion channels may exist in a complex that contains regulatory protein kinases and phosphatases.     

葡萄糖酸钠对光滑球拟酵母CCTCC M202019能量代谢和丙酮酸积累的影响

在好氧条件下,光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019能够利用葡萄糖酸钠为唯一碳源生长并积累少量丙酮酸。在含有90 g/L葡萄糖的培养基中,16 h时添加10 g/L葡萄糖酸钠,与100 g/L葡萄糖作为唯一碳源的对照组相比,细胞质量浓度、葡萄糖消耗速率、丙酮酸生产强度分别提高7.96%、13.04%和32.81%;其原因在于葡萄糖酸钠的添加,使胞内NAD+浓度提高了29.73%,NADH/NAD+比值和ATP含量分别下降26.89%和8.50%,此变化显著缓解了NADH和ATP对于糖酵解途径的抑制作用,从而显著加快糖酵解速率。     

Crystal structures of the adenylate sensor from fission yeast AMP-activated protein kinase

The 5'-AMP (adenosine monophosphate)-activated protein kinase (AMPK) coordinates metabolic function with energy availability by responding to changes in intracellular ATP (adenosine triphosphate) and AMP concentrations. Here, we report crystal structures at 2.9 and 2.6 A resolution for ATP- and AMP-bound forms of a core alphabetagamma adenylate-binding domain from the fission yeast AMPK homolog. ATP and AMP bind competitively to a single site in the gamma subunit, with their respective phosphate groups positioned near function-impairing mutants. Unexpectedly, ATP binds without counterions, amplifying its electrostatic effects on a critical regulatory region where all three subunits converge.     

The product of the human c-erbB-2 gene: a 185-kilodalton glycoprotein with tyrosine kinase activity

Antibodies were raised against a synthetic peptide corresponding to 14 amino acid residues at the COOH-terminus of a protein deduced from the human c-erbB-2 nucleotide sequence. These antibodies immunoprecipitated a 185-kilodalton glycoprotein from MKN-7 adenocarcinoma cells. Incubation of the immunoprecipitates with (gamma-32P)ATP resulted in the phosphorylation of this protein on tyrosine residues. These results indicate that the human c-erbB-2 gene product is the 185-kilodalton glycoprotein that is associated with tyrosine kinase activity. Although the c-erbB-2 protein was predicted to encode a protein very similar to epidermal growth factor (EGF) receptor, EGF did not stimulate this kinase activity either in vivo or in vitro.