5种苹果属植物GAI基因的克隆及生物信息学分析

【目的】研究DELLA家族的成员GAI在调控植物株型形成方面的生物学功能。【方法】从5种苹果属植物(‘国光’、‘武乡海棠’、‘SH6’、‘比利时垂枝’、‘比利时直立’)中分离得到GAI基因,应用多种生物学工具分析其序列特征。【结果】序列分析表明,GAI的CDS序列长度为1 875bp,编码624个氨基酸;GAI的基因组序列长度与其对应CDS序列长度相同;GAI蛋白具有亲水性,主要定位于细胞质;5种苹果属植物的GAI序列相似性极高,都具有DELLA家族和GRAS家族特有的典型结构。【结论】试验结果暗示这5种苹果属GAI基因可能在苹果株型形成方面发挥重要功能。     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

短枝型苹果MdRGL基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

一个亚洲棉MYB家族新基因的克隆及特征分析

【目的】克隆亚洲棉MYB家族的一个新基因（GaMYB2）,研究其表达模式,分析其预期编码蛋白。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆亚洲棉MYB2的cDNA序列全长;应用生物信息学软件分析该基因及预期编码蛋白的特征;采用实时荧光定量PCR技术对该基因的组织特异性和PEG6000模拟干旱胁迫处理下的表达模式进行分析。【结果】从亚洲棉(Gossypium arboreum L.)中克隆了MYB家族的一个新基因MYB2,该基因全长1 117 bp,ORF全长840 bp,编码279个氨基酸,含有MYB保守域,氨基酸的BALSTP分析表明GaMYB2氨基酸序列与已报道的水稻（BAA23338.1）、小麦(AAT37168.1)等的序列有40.50%到68.20%的相似性。亚细胞定位表明该基因在细胞核中表达,实时荧光定量PCR结果表明该基因在根和花中的表达量较高,并且响应17%的PEG6000模拟干旱胁迫处理,上调表达。【结论】GaMYB2是亚洲棉MYB家族的一个新基因,并认为该基因可能在棉花调控干旱胁迫的生理适应过程中发挥重要作用。     

玉米干旱诱导表达基因ZmBTF3b的克隆与表达分析

【目的】克隆玉米ZmBTF3b并研究其参与逆境反应的分子机制,为揭示玉米抗逆分子机制奠定基础。【方法】应用生物信息学方法分析ZmBTF3b启动子序列特点;应用酵母单杂交方法验证该基因编码转录因子的转录激活活性;应用实时荧光定量PCR方法分析ZmBTF3b在玉米不同组织中的表达差异及其在非生物胁迫下的表达模式。【结果】从玉米抗旱自交系CN165中克隆得到干旱诱导表达基因ZmBTF3b,该基因编码蛋白含有169个氨基酸,具有新生多肽复合体(nascent polypeptide-associated complex,NAC)保守结构域;酵母单杂交试验证明ZmBTF3b具有转录激活功能;实时荧光定量PCR结果表明,ZmBTF3b在玉米花丝、幼穗、幼胚中表达量较高。ZmBTF3b受脱水干旱胁迫和PEG模拟干旱胁迫诱导根上调表达,而受冷、NaCl、ABA和SA诱导下调表达。【结论】ZmBTF3b编码蛋白具有转录因子的基本特性,在应答逆境胁迫特别是干旱胁迫时起重要作用。     

棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

【目的】DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用。研究棉花中DELLA基因的功能。【方法】从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型。【结果】序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域。采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47%以上。转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型。【结论】过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育。     

苹果砧木‘SH6’叶绿体基因组序列特征和比较分析

【目的】为了解析苹果矮化中间砧‘SH6’叶绿体基因组特征及其进化关系。【方法】以苹果矮化中间砧‘SH6’为试材，通过HIFI测序，利用Organelle＿PBA软件进行叶绿体基因组从头组装，分析其叶绿体基因组特征。【结果】结果表明，‘SH6’叶绿体基因组大小为160 069 bp,具有典型的四分结构，包括大单拷贝区域、小单拷贝区域和两个反向重复区域，长度分别为88 184 bp、19 181 bp、26 352 bp和26 352 bp。在‘SH6’叶绿体基因组中，分别注释了蛋白质编码基因、tRNA和rRNA,其数量分别为86、36和8。此外，整合已发表的‘国光’、河南海棠、2个野生苹果和桃(Prunus persica)的叶绿体基因组数据来构建系统发育树，发现苹果中间砧‘SH6’与欧洲森林苹果聚在一枝上。【结论】推测苹果矮化中间砧品种‘SH6’与欧洲森林苹果关系较为密切。     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS2,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号:GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号:GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因的发育表达分析

【目的】分析斜纹夜蛾蛋白二硫键异构酶基因(SlitPDI)的序列特征和发育表达模式,为解析SlitPDI蛋白在斜纹夜蛾生长发育过程中的生理功能提供依据。【方法】采用DNASTAR对SlitPDI基因序列特征和进化关系进行分析,并以实时荧光定量PCR研究SlitPDI基因在斜纹夜蛾2龄、4龄、6龄幼虫及蛹和新羽化雌、雄成虫共6个不同发育时期的相对表达量。【结果】SlitPDI基因编码494个氨基酸,预测该蛋白分子量约55.3 kD,理论等电点(pI)为4.52。氨基酸序列分析结果表明,SlitPDI蛋白序列具有PDI家族的典型特征:在序列的N端及C端均具有二硫键/巯基氧化还原位点-CGHC-。系统发育进化树分析结果表明,SlitPDI蛋白与意大利蜜蜂(Apis mellifera)的PDI蛋白序列一致性最低,为50.2%;与家蚕(Bombyx mori)的PDI蛋白序列一致性最高,为83.4%。斜纹夜蛾不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明,SlitPDI基因在4龄幼虫中的表达量最高,其表达量是基准含量2龄幼虫的1.27倍;在刚羽化雌、雄成虫的表达量也较高,分别为基准含量2龄幼虫的1.03和1.12倍。【结论】SlitPDI蛋白属于I类PDI家族蛋白,SlitPDI基因在斜纹夜蛾4龄幼虫和新羽化成虫中的表达量相对较高。     

水肥处理对苹果幼树树体结构、叶片及光合作用的影响

[目的]为了探讨不同水、肥组合处理对苹果幼树的作用。[方法]以天红2号/SH40/海棠为试材,研究不同灌溉方式、不同基肥与追肥组合处理对苹果幼树树体结构、叶片及光合作用的影响。[结果]不同水、肥组合处理对苹果幼树树体结构、叶片各参数及光合作用的影响程度各异,其中以基肥为432 000 kg/hm2,追肥为尿素480 kg/hm2和有机肥915 kg/hm2+0+有机肥915 kg/hm2和叶面肥(1%尿素)组合的处理在半根灌溉、全根灌溉条件下均有利于促进树体枝条及叶片的生长,提高叶片厚度、单叶面积及SPAD,同时有利于果树光合作用的提高,并且在全根灌溉条件下效果更佳。[结论]选择合理的水、肥组合更有利于苹果的生长。     

鲈形目线粒体DNA蛋白编码基因的适用性分析

[目的]对线粒体DNA 13种蛋白质编码基因的系统进化分析能力进行了评估。[方法]单个基因和基因拼接序列比较,综合考虑序列的信息量和邻位连接法构建系统进化树的置信度。[结果]按分类阶元不同将基因都分成不同的4等。在鲈形目的科间阶元,最好的为ND6和cox2 好的序列为ND5和ND4 ND4L、ND3和ATP8差 包括Cyt b、cox1在内的其余6种基因为中等 在属内种间阶元,最好的为ATP6和cox2 好的序列为ND2和cox1 ND6、ND3和ATP8差 包括Cyt b在内的其余6种基因为中等。另外,分析揭示序列长度的增加可以提高系统进化树的置信度,且属内物种间比较时序列长度的影响小于高级阶元。[结论]线粒体DNA蛋白质编码基因的信息分布具不均一性,需分类阶元选择最佳基因和组合。     

GA含量与其合成酶基因在‘长富2号’苹果及其短枝型芽变品种之间的比较分析

【目的】研究苹果枝条节间长度与内源激素赤霉素（GA）水平及GA合成关键酶基因序列和表达之间的关系,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】以‘长富2号’苹果及其短枝型芽变‘龙富短枝’的枝条和叶片为试材,通过对花后4个时期GA含量的测定及GA合成途径中关键基因的克隆及表达,研究枝条生长过程中GA与枝条节间长度的关系。【结果】在花后80 d,GA含量在非短枝型苹果及其短枝型芽变中差异显著,短枝型芽变品种中GA含量低于非短枝型品种。序列分析表明,GA合成关键酶基因GA20-氧化酶（GA20ox）和贝壳杉烯氧化酶（KO）的cDNA序列在‘龙富短枝’和‘长富2号’中完全一致,无碱基的突变、插入或缺失现象发生。实时荧光定量PCR分析表明,在花后20 d和80 d,GA20ox和 KO的相对表达量在‘龙富短枝’和‘长富2号’之间差异显著,短枝型芽变品种中的相对表达量显著低于非短枝型苹果。【结论】GA含量差异和GA合成关键酶基因差异表达与短枝型苹果枝条节间长度相关联,低GA含量和GA合成关键酶基因的下调表达抑制了苹果枝条的伸长。     

枇杷芽变新品系‘川早枇杷’的果实品质、特候期和枝条组织形态学研究(英文)

[目的]探讨枇杷变异新品系———‘川早枇杷’的生长特性及果实品质。[方法]以‘川早枇杷’和‘早钟六号’2个枇杷品种为材料,采取石蜡切片和田间调查相结合的方法,对2个品种的枝条组织形态和物候期进行了对比分析。[结果‘]川早枇杷’的抽梢和展叶时间均比早熟品种‘早钟六号’提前约半个月至1个月左右;‘川早枇杷’的花期和果实成熟期比早熟品种‘早钟六号’提前3个月‘;川早枇杷’春梢各组织在春梢中所占比例为表皮3.7%,皮层薄壁组织14.5%,维管组织15.9%,髓65.9%‘,早钟六号’各组织比例分别为3.1%、42.5%、6.9%、47.5%。[结论]在物候期方面,‘川早枇杷’早于目前广泛栽培的早熟枇杷品种‘早钟六号’,是一种重要的枇杷种质资源。     

香花油茶优良砧木品系筛选研究

[目的]初步筛选香花油茶优良砧木品系,为油茶砧木的开发利用提供依据。[方法]用香花油茶作为砧木嫁接普通油茶岑软3号,对不同砧木品系的嫁接亲和性和嫁接苗的生长情况进行调查研究,并应用主成分分析法综合评定砧木品系的优劣。[结果]香花油茶作为砧木嫁接普通油茶,全部砧木品系嫁接苗的保存率为87%以上,其中87.5%的砧木品系嫁接苗保存率超过90%,且各砧木品种嫁接苗的抽梢率均高于90%;应用主成分分析法将保存率、抽梢率等6个性状指标转换为3个主成分,并将各主成分因子的得分值与主成分贡献率相乘,获得每个砧木品系嫁接苗的综合得分值。[结论]香花油茶和普通油茶之间亲和性较强;各砧木品系综合得分排名前3位的分别为P_(14)、P_(2)和P_(24)。     

3个荔枝品种盛花期光合特性的比较

【目的】阐明不同荔枝Litchi chinensis品种盛花期叶片光合作用的日变化规律及光合特性,为荔枝开花期的栽培管理提供指导。【方法】在自然条件下,利用LI-6400便携式光合测定系统对‘妃子笑’、‘桂味’和‘糯米糍’3个主栽荔枝品种盛花期的光合作用参数进行测定。【结果】3个品种的净光合速率(Pn)日变化均呈双峰曲线,首峰出现在10:30,次峰出现在13:30,午休现象明显。‘糯米糍’的Pn日均值(3.76μmol·m~(-2)·s~(-1))显著高于‘妃子笑’(2.38μmol·m~(-2)·s~(-1))和‘桂味’(2.41μmol·m~(-2)·s~(-1))。3个荔枝品种的Pn都与光合有效辐射(PAR)呈显著正相关,‘桂味’的Pn与气温(θa)呈显著正相关,‘糯米糍’的Pn与气孔导度(Gs)呈显著正相关。【结论】PAR是影响3个荔枝品种Pn的主要生态因子,其他因子对荔枝叶片光合作用的影响因品种不同存在差异。     

5个矮化中间砧对‘沂水红’富士苹果生长、结果和叶片矿质元素积累的影响

【目的】探讨5个不同矮化中间砧对‘沂水红’富士树体生长发育的影响,为推广中国培育的具有自主知识产权的苹果矮化砧木提供依据。【方法】以5年生的矮化中间砧苹果幼树(‘沂水红’富士/M26、SH6、青砧2号、辽砧2号、M9T337/平邑甜茶)为试材,连续3年对不同砧穗组合树体生长、果实产量、品质及生长期叶片矿质元素进行测定分析。【结果】从嫁接复合体主干生长一致性看,辽砧2号与基砧和接穗的亲合性最好;在新梢生长动态上,不同砧穗组合虽相似,但SH6树体新梢年生长量始终处于较高水平;在枝类组成上,M9T337树体短枝比例最高(65.2%),长枝比例最小(11.1%);在单株平均产量上,M26较高;各组合果实的单果重、果形指数、果实硬度、可溶性固形物和可滴定酸含量差异不大。生长期,辽砧2号、青砧2号和SH6上的叶片氮、磷、钾、钙和镁含量处于较高水平,辽砧2号叶片铁含量在整个生长期保持较高水平;生长后期,M9T337钙含量略高。【结论】SH6、青砧2号和辽砧2号作为中间砧嫁接‘沂水红’富士具有亲合性好,树体小,枝类组成合理,产量稳定,果实品质优良等特点。     

新型苹果矮化砧木辽砧2号抗寒性试验

[目的]为选育抗寒的苹果矮化砧木提供依据。[方法]用枝条电泳和区域栽植的方法,对新型苹果矮化砧木——辽砧2号进行抗寒性试验。[结果]在相同条件下,辽砧2号半致死温度比M26低-7.7℃,比抗寒性极强的山丁子仅低-2.2℃。在辽宁省新宾县、铁岭县年平均气温为6.1～7.0℃的寒地苹果栽培区栽植,4年生的辽砧2号砧木存活率达95%,比寒富苹果品种的存活率高15%,表现出很强的抗寒性。[结论]枝条电导是检测果树抗寒性的有效方法。