宁夏葡萄自然发酵过程中酵母菌的分子生物学鉴定

【目的】探明宁夏地区葡萄自然发酵过程中酵母菌的多样性,为酵母菌资源的开发利用提供依据。【方法】应用26S rDNA D1\D2区序列,分析鉴定了分离自宁夏广夏三基地葡萄园的21株野生葡萄酒酵母菌,在此基础上又构建了21株被测菌株与相关菌种模式株的系统发育树,分析了供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及其分类地位。【结果】序列分析和系统发育树分析表明,21株被测菌株鉴定为6属7种,分别为拜耳接合酵母(Zygosaccha-romyces bailii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、罕见有孢汉生酵母(Hanseniaspora occidentalis)、葡萄汁有孢汉生酵母(Hanseniaspera uvarum)、美极梅齐酵母(Metschnikowia pulcherrima)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientali)和克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。【结论】宁夏葡萄酒产区的相关酵母具有多样性。     

1株耐高温纤维素酶产生菌的分离与鉴定

从环境样品中筛选得到1株耐高温纤维素酶产生菌A13。形态及生理生化特征测定结果表明,A13菌株与芽孢杆菌属(Bacillus)中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的特征基本一致。测定了该菌株的16S rDNA序列并根据16S rDNA构建了系统发育树,在系统发育树中,A13菌株与地衣芽孢杆菌形成一个类群,序列同源性为90%。最终确定该菌株为地衣芽孢杆菌。     

天山一号冰川产蛋白酶酵母菌的筛选及其系统发育分析

[目的]筛选天山一号冰川底部沉积层耐低温的产蛋白酶菌株,研究其生理生化特性并做系统发育分析.[方法]以天山一号冰川底部沉积层中耐低温产蛋白的酵母菌株为材料,用Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(YPD)培养基活化60株酵母菌;再用选择性培养基筛选产蛋白酶的菌株,观察菌落形态;测定产酶菌株最适温度;最后基于26S r DNA基因D1/D2区序列进行系统发育分析.[结果]从60株酵母菌中共筛选出10株产蛋白酶菌株,其中产酶优势菌为BCY-8、BCY-20,产酶酵母细胞平均大小为2.60～5.00μm,最适生长温度为24℃.经系统发育分析可知,10株产酶酵母菌属于隐球菌(Cryptococcus)、红酵母属(Rhodotonla)、南极酵母(Antarcticyeast)、Uncultured fungus、Mazocraeoides gonialosae.[结论]研究可为低温蛋白酶生物技术的研发奠定基础.     

云南弥勒葡萄酒产区云中舞葡萄酵母菌多样性研究

【目的】云南弥勒是中国西南地区传统的葡萄酒产区,以该产区云中舞葡萄为试验材料,对其果皮以及自然发酵过程中酵母菌的多样性进行研究。【方法】利用WL培养基的菌落培养形态,酵母细胞微观形态和分子生物学相结合的分类鉴定方法对弥勒云中舞葡萄果皮以及自然发酵过程中酵母菌进行分离鉴定和多样性分析。【结果】从云中舞葡萄分离得到的80株酵母菌共分为5个培养类型,采用26S r DNA D1/D2区序列分析对选出的具有典型特征的15株酵母菌进行了分子生物学鉴定,序列比对分析和WL培养基聚类表明80株被测菌株鉴定为5属5种,分别为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)、库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)和桔假丝酵母(Candida quercitrusa),显示了酵母菌种类多样性;其中葡萄汁有孢汉逊酵母占了所分离酵母总数的43.18%,为弥勒云中舞葡萄相关酵母菌的优势种。通过构建15株被测菌株与相关模式菌株的系统发育树,分析酵母菌的遗传多样性和菌株间的亲缘关系,结果表明:各供试菌株均与各自相关模式菌株聚为一枝,和序列比对鉴定结果相一致。另外,鉴定为同种酵母的不同菌株间以及和模式菌株间的亲缘关系具有一定的差异,显示了一定的遗传多样性。【结论】云南弥勒云中舞葡萄相关酵母菌具有多样性的特点,本研究为进一步选育优良的本土葡萄酒酵母提供了材料和参考。     

刺参机体酵母菌组成及其拮抗活性的研究

采用PDA、YPD、MEA培养基从刺参Apostichopus japonicus的体表、肠道和呼吸树分离出23株酵母菌,使用玻璃珠破碎方法提取其DNA,然后用酵母菌通用引物NL-1/NL-4从DNA中成功扩增出26S rDNA片段,将PCR产物迸行测序,将各菌株序列在GenBank数据库中进行检索,从Blast比对结果中取相似性最高的序列,用Mega 4.0软件对所有序列进行聚类分析,采用邻接法构建系统发育树.结果表明:从大连柏岚子海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、梅奇酵母属和丝孢酵母属,从大连市黑石礁海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、假丝酵母属、德巴利氏酵母属、有孢汉逊酵母属和毕赤酵母属;以8株刺参病原菌作为指示菌,采用双层琼脂扩散法对分离菌株的拮抗活性进行测定,获得拮抗酵母菌17株,占总测试菌株的73.9％,从刺参机体的体表、肠道和呼吸树可以筛选出不同得率的活性菌株,其抗菌谱和活性强度各不相同,其中C11菌株的抗菌谱最广,抗菌活性最强;从肠道分离出的拮抗菌C11、C14和C21菌株的胞外产物经硫酸铵沉淀后也具有抗菌活性,C14菌株胞外产物经65％硫酸铵沉淀获得的粗提物对热和蛋白酶K敏感,表明其拮抗物质为蛋白质.     

一株解脂耶氏酵母菌的鉴定及其系统发育树分析

从未发酵猪粪中分离出一株酵母样菌株7B3,用BioMerieux Vitek公司的酵母样生化鉴定卡（yeast biochemical card）鉴定该菌为解脂耶罗维亚酵母。为了进一步确定该菌的分类学地位,测定了其18S rDNA序列,分析了相关菌株的同源性,构建其系统发育树。结果表明,该菌株与Yarrowia Lipolytica M相似度最高。     

番茄灰霉生防菌XF的筛选、鉴定及生防因子的初步探索

菌株XF是一株分离自甘肃省兴隆山原始森林土壤的对番茄灰霉病具有良好防治效果的拮抗细菌。通过对该菌株的形态学特征观察以及16S rDNA序列的分析鉴定,确定菌株XF为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。拮抗试验表明,菌株XF能显著抑制番茄灰霉菌菌丝的生长,抑制率可达66.35%,并使菌丝出现异常分枝,囊泡状畸形且伴有细胞壁破裂,内涵质外泄的现象。菌株XF发酵60 h,10%无菌滤液对番茄灰霉菌菌丝的抑制率为98.19%。生化分析测定结果表明,菌株XF的次生代谢物含有蛋白酶、葡聚糖酶、几丁质酶、铁载体以及生长素IAA,表明该菌株具有生物防治潜力。     

纤维素酶产生菌的鉴定及其混合发酵条件优化

分离筛选到的4株纤维素酶活较高的菌株D6、D7、B7和D1,根据形态特征初步判断为3株细菌、1株放线菌,其16S rDNA序列同源性分析结果发现D6、D7、B7与Bacillus sp.的同源性为99%,系统发育树分析与Bacillus sp.遗传关系最近,D1与Streptomyces zaomyceticus的同源性为99%,系统发育树分析与Streptomyces zaomyceticus遗传关系最近;对4株菌株进行单独与混合发酵培养,结果表明菌株组合D6/D7混合培养后的酶活显著高于其单菌培养,其在培养温度37℃、培养基初始pH值为8.0、接种量为2%(V/V)、D6/D7接种比例为2∶1(V∶V)下的酶活最高,可达到79.42 U/mL。     

高效溶栓菌株的筛选鉴定及活性测定

以日本纳豆、重庆江津豆豉、忠县豆腐乳为原料,采用酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛,得到18株产溶栓酶的菌株.通过纤维蛋白平板实验,从忠县豆腐乳中筛选出1株具有较高溶栓活性的菌株FR-033(登录号:HQ009804),菌株经液体发酵后获得含酶发酵液,采用硫酸铵分段盐析及sephadexG-50凝胶层析进行纯化,获得较高纯度的溶栓酶,酶活力为2 163 IU/mL.进一步对FR-033菌株的形态和生理生化特征进行研究.利用细菌16S rDNA通用引物对16S rRNA进行PCR扩增并测序,得到1444 bp长度的DNA序列,通过BLAST软件在NCBI网站收索其同源性性序列,利用PAUP4.0和MAGE4软件绘制系统发育树,结果表明:菌株FR-033与枯草芽孢杆菌(Bacil-lus subtilis)的16S rRNA序列同源性达99%以上,在系统发育树中,菌株FR-033与枯草芽孢杆菌在同一支上,且遗传距离最短;FR-033的形态及大部分生理生化特征与枯草芽孢杆菌极为相似,表明该菌株是枯草芽孢杆菌(Ba-cillus subtilis)的一个高效的产溶栓酶菌株.     

海洋低温几丁质酶菌株筛选、鉴定及酶谱分析

以胶体几丁质为唯一碳源,从大连渤海湾的底泥样品中分离到1株高产低温几丁质酶的海洋细菌,命名为DL-06。由菌株的形态特征结合16SrDNA系统发育分析,初步确定该菌株属于交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-06)。该菌株经30h摇瓶发酵后测定粗酶液几丁质酶酶活为9.184U/mL,最适反应温度为15℃,60℃孵育1h仍保持50%以上的酶活性,表明该低温酶具有一定热稳定性。经SDSPAGE及酶谱分析,该菌株能够产生至少3种以上不同分子质量的几丁质酶组分。Pseudoalteromonas sp.DL-06产几丁质酶在低温下高活性与热稳定特点,使其具有潜在的工业应用价值。     

一株褐腐真菌产纤维素酶活力的分析

[目的]获得一株可降解纤维素的褐腐真菌,并且分析其产酶特性.[方法]从腐朽木材上分离出一株褐腐真菌,分析该菌株的形态学特征、生物学特性,并且通过液体发酵培养,测定该菌株的2种纤维素酶活力.[结果]该菌株为栗黑拟层孔菌.发酵试验表明,在初始pH 6.0、CMC-Na 0.5 g/L、KH2PO40.5 g/L、CaCl2 0.5 g/L、VB1 0.5 g/L、MgCl22 mmol/L、酵母粉5.0 g/L、酒石酸铵0.5 g/L的条件下,培养5d时纤维素酶活力最高,内切葡聚糖苷酶（CMCCase）为21.71 U/ml,β-葡聚糖苷酶为10.69 U/nml.[结论]该试验为进一步研究褐腐真菌降解木质纤维素的机制提供前期基础.     

可传一代应用于饮用型酸奶的直投式菌种筛选

利用来源于丹麦科汉森(Chr.Hansen)公司、美国杜邦丹尼斯克(DANISCO)公司和荷兰帝斯曼(DSM)公司的16个混合型直投式菌种,通过传一代前后的菌株比例、发酵活力表现、产品稳定性及感官特性、传一代发酵剂在饮用型酸奶中应用后产品的后酸特性、后风味特性及乳酸菌活菌数稳定性的综合评价,最终筛选出适宜用于传一代应用的最优菌种为DSM公司的CY-124。其传一代后仍然含有较高数量的杆菌,发酵时间在3.5h以内,对发酵活力有着明显改善,且在饮用型酸奶中应用后产品的后酸化特性、后风味特性及菌株数量稳定性良好。     

乌鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法,对分离于当地典型发病乌鸡群的IBDV(WJ株)进行了VP2基因的克隆与序列分析,并和相关毒株进行了比较。结果表明,WJ株与标准血清 型STC株的核苷酸和氨基酸的同源性只有91.39%和92.74%,而与超强毒株UK661和从当地鸡群中分离的超强毒株HN01株的核苷酸和氨基酸的同源性则较高,其中,与其核苷酸同源性分别为95.43%和95.87%,与其氨基酸同源性均为96.77%。且该毒株的VP2基因序列完全具备超强毒株的主要特征。由此说明,分离于当地发病乌鸡群的IBDV为超强毒株,并和当地流行的鸡IBD超强毒株有较高的同源性,但也有明显的差异。     

一株水华鱼腥藻溶藻细菌的分离鉴定和溶藻特性

从不同来源的水体和土样中，筛选出对水华鱼腥藻具有溶藻作用的溶藻菌株SLW6。对菌株SLW6进行形态特征分析和生理生化鉴定，及16S rDNA序列分析，并研究了溶藻菌在不同培养时期、不同pH条件下对菌株SLW6溶藻效果的影响，探究了该菌株对水华鱼腥藻的溶藻方式。结果表明：菌株SLW6呈革兰氏阴性，V-P试验、明胶液化试验、甲基红试验为阴性，过氧化氢试验、硝酸盐还原试验都为阳性，菌株SLW6与产碱杆菌属的Alcaligenes faecalis（NR113606.1）的同源性达到99.65%，结合形态学特征，生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，初步判断溶藻菌株SLW6为产碱菌属（GenBank登录号为OP363821）。超声辅助热乙醇提取叶绿素a，分光光度法测定叶绿素a含量，用叶绿素a含量变化计算溶藻率，结果表明SLW6处于对数期时的溶藻效果最好，溶藻率达89.45%；在pH=7条件下，溶藻效果较好，溶藻率为47.03%；溶藻菌SLW6对水华鱼腥藻的作用方式是直接溶藻为主间接溶藻作用为辅。     

1株番茄青枯病内生拮抗细菌的分离鉴定及盆栽防效

从番茄植株分离得到内生细菌18株,其中2株对番茄青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)有较强的拮抗作用,菌株QGJ–6的拮抗圈直径最大,为20.2 mm,盆栽试验中对番茄青枯病的生防效果达82.4%。逐步诱导拮抗内生细菌QGJ–6对硫酸链霉素产生抗性,通过灌根接种的方法,验证了菌株QGJ–6能在番茄的根、茎、叶中定殖。基于菌株QGJ–6的形态特征、生理生化特征以及16S r DNA序列分析结果,将其鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。     

几种菌种保藏方法对地生枝顶孢活力的影响

用3种不同的保藏方法对地生枝顶孢菌种进行保藏处理,结果表明,灭菌蒸馏水室温保藏在长达30个月后完全保存了活力;冷冻干燥的菌种在25℃破坏性条件下12个月后仍然存活;黄豆粉培养基上4℃冰箱保藏存活6个月;SDAY培养基4℃冰箱保藏效果最差,只有1个月。     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

一株鸭源H9亚型禽流感病毒分离株生物学特性研究

对分离到的1株鸭源H9N2亚型禽流感病毒(NJ01株)的生物学特性进行了研究。研究结果显示:其静脉致病指数IVPI为0,脑内致病指数ICPI为0.26,血凝解脱时间NHAT为慢,血凝热稳定时间HOT为30 m in。以108.0ELD50/羽的剂量静脉感染26日龄非免疫鸭,可使40%鸭致死,且从攻毒后存活鸭1 d+2 d喉拭子中100%分离到该病毒;而以相同剂量静脉感染1月龄SPF鸡后不出现死亡,但攻毒后4~6 d的泄殖腔拭子中,均可100%再分离到该病毒。毒株血凝素基因的RT-PCR试验结果显示,与1997年香港3个分离株的同源性为94.8%~96.0%,其HA裂解位点处氨基酸序列为-RSSRG-。研究结果表明该NJ01株为低致病性禽流感病毒,属欧亚大陆分支,在SPF鸡及非免疫鸭体内均能很好地复制。     

TMPD降解菌Staphylococcus pasteuri的鉴定

通过形态学观察、生理生化特征测定和16S rDNA序列同源性分析,对1株TMPD降解菌(LF-2)进行了鉴定.结果表明:LF-2的形态及主要生理生化特征与葡萄球菌属一致,而且与巴氏葡萄球菌(AJ717376)的16S rDNA序列具有99.80%的同源性;在系统发育树上构成一个分支.由此确定TMPD降解菌LF-2属于巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri).