CBF转录因子及其在植物抗寒性中的作用

CBF转录因子在抗寒性方面起重要作用,低温可诱导CBF转录因子的表达。CBF转录因子能够特异结合启动子中的CRT/DRE元件,激活COR等基因的表达,从而增强植株抗寒能力。目前已有许多成功将CBF基因导入植株的报道,为植物抗寒育种提供了一条新途径。     

与逆境胁迫相关的rd29A启动子和CBF2基因的克隆及其表达载体构建

以拟南芥为材料,通过PCR扩增成功地克隆了逆境诱导型启动子rd29A和CBF2转录因子.序列分析表明,951 bp的rd29A序列包含完整的DRE、ABRE等4种保守顺式作用元件;651 bp的CBF2基因包含了完整的AP2 DNA结合域以及特异的氨基酸序列PKKPAGRKKFRETRHP和FADSAWR.同时,构建了由rd29A启动子调控的CBF2基因的植物表达载体.     

烟草DREB转录因子新基因的克隆与功能分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE),从烟草中克隆到1个新的烟草DREB基因,命名为NbDREB2a.序列分析表明该基因全长1191 bp,编码330个氨基酸,具有典型的DREB转录因子保守的AP2结构域.实时RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,受低温、干旱和高盐诱导.酵母转录激活实验证明,该基因可以特异性结合DRE顺式作用元件,并能激活报告基因的表达.为了研究该基因在植物抗逆反应中的功能,利用农杆菌介导法,将该基因转化到模式生物拟南芥中,筛选到了单拷贝插入的、纯合的拟南芥株系;对获得的转基因拟南芥进行干旱及高盐处理,结果表明,与对照相比,超量表达该基因能够明显地提高拟南芥对干旱及高盐的抗性.     

DREB转录因子的表达调控

植物DREB转录因子属于AP2/ERF转录因子家族,能够特异性地结合启动子区的DRE/CRT顺式作用元件,调控下游逆境应答基因的表达,从而在植物应对低温、干旱、高盐等非生物胁迫中发挥重要作用。围绕对DREB转录因子的调控,重点介绍了其表达、功能、降解等过程中涉及的调控机理方面的研究成果,并对DREB转录因子未来的研究方向进行了展望。     

盐地碱蓬2个DREB1/CBF基因的克隆与表达调控分析

【目的】从盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）中克隆2个DREB1/CBF,分析其序列特征、编码蛋白的亚细胞定位和转录激活活性,以及在非生物胁迫下的表达模式,为进一步研究盐地碱蓬的抗逆机制提供依据。【方法】利用同源克隆法获得盐地碱蓬2个DREB1/CBF片段,采用RACE技术克隆获得cDNA全长序列,分别命名为SsCBF1和SsCBF2。运用生物信息学软件对2个SsCBF及其编码蛋白进行分析,并将它们分别与GFP融合构建植物表达载体,通过基因枪转化法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,观察它们编码蛋白的亚细胞定位。利用酵母单杂交系统研究2个SsCBF与DRE/CRT顺式作用元件的结合特异性和转录激活活性。采用Real time-PCR研究2个SsCBF在低温、NaCl、PEG以及ABA处理下的表达模式。【结果】 SsCBF1编码一个225个氨基酸的蛋白,预测分子量为25.4 kD,理论等电点为4.84。SsCBF2编码一个由260个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为28.6 kD,理论等电点为5.05。SsCBF1和SsCBF2均含有1个典型的AP2/ERF保守结构域,在核苷酸和氨基酸水平上分别具有53.5%和45.4%的同源性,而2个基因的AP2/ERF结构域在核苷酸和氨基酸水平上分别具有76.2%和87.3%的相似性。SsCBF1、SsCBF2归属于DREB亚组的A-1组,定位于细胞核内,均能与DRE/CRT顺式作用元件特异性结合,并激活下游报告基因的表达。低温、干旱、高盐和ABA能够诱导SsCBF1表达,而SsCBF2在低温处理下表达量上调,但对干旱、高盐和ABA处理不响应。【结论】SsCBF1和SsCBF2是盐地碱蓬的2个胁迫应答转录因子。在盐地碱蓬中,SsCBF1通过依赖ABA途径参与对高盐、干旱和低温等非生物胁迫的应激调控,而SsCBF2则通过不依赖于ABA途径对低温胁迫产生响应。     

PtrDREB28转录因子的克隆及抗逆性

DREB/CBF转录因子响应植物干旱、高盐和低温等非生物胁迫应答是通过特异结合DRE/CRT顺式作用元件。利用RT-PCR技术从毛果杨克隆PtrDREB28转录因子基因,用基因枪法对其进行亚细胞定位分析,结果表明其定位在细胞核中;利用农杆菌介导法对野生型大青杨进行遗传转化,并对转基因株系进行抗逆性分析,结果显示经高盐胁迫处理的转基因株系的耐受性明显高于野生型植株;通过测定和比较经盐胁迫处理后转基因株系和野生型植株的丙二醛质量摩尔浓度和相对电导率,发现转基因株系的丙二醛质量摩尔浓度和相对电导率均显著低于野生型植株,表明PtrDREB28基因的过表达可以显著提高杨树耐盐性,由此推测PtrDREB28转录因子可能参与杨树逆境胁迫应答过程。     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

胡杨中两个新DREB类基因的克隆、序列分析及转录激活功能研究

DREB转录因子(干旱应答元件结合因子)是逆境适应中的关键调节因子。该类转录因子的特点是拥有保守的AP2/EREBP(APETALA2/乙烯应答元件结合蛋白)结构域,能够特异性地与抗逆基因启动子上的DRE元件相结合,在低温、干旱和盐碱等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达。本研究从胡杨中分离出2个编码DREB2类蛋白的基因PeDREB3和PeDREB4。PeDREB3和PeDREB4在胡杨根、茎、叶中都有表达。序列分析显示,PeDREB3和PeDREB4均含有非典型性AP2/ERF结构域,即在AP2/EREBP结构域的第2个β折叠和第3个β折叠处多出8个氨基酸残基,用改进的酵母单杂交技术发现PeDREB3和PeDREB4能够在酵母中激活下游报告基因的表达,具有转录活性。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF3基因,将其与CaMV35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35S-CBF3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。经PCR检测鉴定,表明CBF3基因已整合到黄瓜基因组中。     

水稻SUPERNUMERARY BRACT(OsSNB)基因应答非生物胁迫和激素的表达特性

AP2转录因子家族普遍存在于植物中,在调控植物发育过程中起到非常重要的作用。前期研究表明,SUPERNUMERARY BRACT(OsSNB)属于AP2转录因子亚家族成员,含有两个保守的AP2结构域,主要参与调控小穗分生组织向花分生组织的转换以及花器官的发育。利用RAP-DB水稻数据库搜索到基因OsSNB,通过序列分析发现 OsSNB启动子序列中含有GCC-box、ABRE、DRE、WRKY等应答非生物胁迫及激素信号的元件;基因表达分析表明,OsSNB基因的表达受NaCl、干旱胁迫和激素ABA以及乙烯前体ACC的诱导。这些结果表明水稻OsSNB基因可能参与调控逆境胁迫反应,在植物生长发育和非生物胁迫的应答中均具有重要功能。     

OsBELL4A调控水稻WOX家族基因表达及水稻幼苗生长和耐逆

根系不仅对地上部分起着重要的支撑作用,也是植物吸收水分和养分的主要器官。为了研究BELL家族因子在植物生长发育及逆境胁迫应答中的功能,通过与拟南芥序列对比,鉴定到水稻4个BELL4同源基因,它们的启动子含有ABRE、GARE、ERE、ARE和DRE等应答逆境胁迫和激素信号的元件。在水稻根中进行实时定量PCR分析表明,这4个BELL4同源基因不仅受到干旱、低温以及盐等逆境胁迫诱导,而且还受到植物激素乙烯、赤霉素以及脱落酸的调控,表明这些基因可能应答多种激素及逆境胁迫。进一步分析OsBELL4A干扰材料表型发现,抑制OsBELL4A基因能够促进WOX家族基因的表达水平,并抑制水稻苗期初生根生长,但使冠根数量增多。这些结果表明水稻BELL4同源基因OsBELL4A在水稻根系发育及逆境胁迫应答中可能具有重要的调控功能。     

簇毛麦Dvblt101基因及其启动子的克隆与序列分析

BLT101家族是一类高度保守的小分子质膜蛋白,在植物抗寒、耐旱、耐盐、脱落酸(ABA)应答等过程中起重要作用。利用PCR技术从抗寒、耐旱的簇毛麦中克隆了Dvblt101基因及其启动子。结果表明,Dvblt101cDNA全长422 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码一条54个氨基酸残基的多肽,并具有2个保守的跨膜结构域;Dvblt101基因长为754 bp,含有2个外显子和1个内含子,启动子区域具有2个干旱/冷应答核心元件(DRE/CRT)、2个MYC结合位点和3个ABA应答元件(ABRE),该基因对低温、干旱等逆境及ABA可能存在广泛的应答。本研究为进一步揭示BLT101家族在簇毛麦抗逆过程中的作用机理奠定了基础。     

高粱GRF基因家族鉴定及在非生物胁迫下的表达分析

生长调控因子（growth regulation factor,GRF）是植物中特有的一类转录因子,在植物激素调控、生长发育以及胁迫应答等多个领域扮演重要角色。对高粱GRF基因家族成员进行筛选鉴定,得到8个家族基因,分析了这些基因的理化性质、保守蛋白序列、基因功能及其共线性,分析了这些基因在非生物胁迫下转录组表达差异。结果表明,GRF基因家族结构较为保守,启动子元件含有干旱、低温、茉莉酸等响应元件,推测该家族基因参与生物及非生物胁迫应答响应。通过盐胁迫和烯效唑处理下的转录组数据分析,得到一个与耐盐相关的基因（SORBI_3002G297800）和一个与激素相关的基因（SORBI_3006G203400）,为进一步探究这些基因在高粱应对非生物胁迫中的作用提供了重要参考。