2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析

 【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪场送检的病料进行PRRSV检测，并对其ORF5基因进行测序，确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征，并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方法】利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测，并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。【结果】260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品，阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明，本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型，与GenBank中高致病性PRRSV（HP-PRRSV）参考毒株的氨基酸同源性为94.6%-100%，并可分为5个亚群，亚群III与HP-PRRSV同源性最高，几乎所有的亚群中和表位（primary neutralizing epitope，PNE）都存在变异，亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008-2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省，进化树分析结果表明，病毒的分型并没有呈现明显的地域性。【结论】2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染，PRRSV流行株为HP-PRRSV，其遗传演化相对稳定，但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉，虽然亚群IV和V只出现在部分省市，但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。     

云南省猪圆环病毒 2 型遗传进化分析

【目的】调查猪圆环病毒 2 型（PCV2）在云南猪群和牛群中的流行情况,明确云南 PCV2 毒株的遗传变异、分子进化趋势。【方法】采用 PCR 方法对云南省 11 个地区 783 份猪、牛的血液、粪便等样品进行PCV2 病原学检测,对 6 份 PCV2 阳性样品进行全基因组扩增、克隆与序列测定,利用 DNAStar 软件比对分析全基因和 ORF2 氨基酸序列,使用 MEGA 软件绘制遗传进化树。【结果】检测样品的 PCV2 阳性率为 48.73%;共测得 6 株 PCV2 全基因组序列,其中 5 株为 1 767 bp, 1 株为 1 768 bp;经遗传发育分析可知,有 PCV2a 亚型 2 株、PCV2b 亚型 2 株、PCV2d 亚型 2 株;6 株 PCV2 毒株同源性在 94.6%~99.9% 之间,与 GenBank 数据库中 20 条参考株同源性在 91.4%~99.8% 之间;6 株 PCV2 亚型的 ORF2 都有其典型的氨基酸位点,PCV2a 毒株在第 80（V80L）氨基酸位点突变为与 PCV2（b/d）一致,PCV2b 毒株在 59（R59K）、63（K63R）、190（A190T）等氨基酸位点突变与 PCV2d 一致。【结论】PCV2 在云南猪群中普遍存在,以 PCV2a、PCV2b 和 PCV2d 这 3 个基因亚型共存为主,且 PCV2（a/b）有向 PCV2d 突变的趋势,荷斯坦奶牛尚未感染 PCV2。     

2007年中国部分地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

 【目的】对采集自上海、江西、山东、江苏、河南和湖南等省的257份进行了PCV2的检测,确定中国PCV2感染情况及分子特征。【目的】设计一对针对PCV2 ORF2的引物,利用PCR对其进行PCV2基因组的检测,对PCV2阳性的样品,进行了ORF2的克隆、序列测定和分析。【结果】结果显示PCV2阳性率为24.51%（63/257）,并能从健康猪群中检测的阳性;各PCV2分离株间ORF2核苷酸序列同源性为84.4%～100%,氨基酸同源性为82.5%～100%,与所属群的不同而不同。【结论】中国有2个群的PCV2毒株在流行,以PCV2b群为主（70.97%,22/31）,但也有PCV2a群毒株（29.03%,9/31）的流行,同时PCV2流行的基因型没有明显的地域间差异。部分毒株符合高致病性PCV2的特征,暗示中国已存在高致病性PCV2的流行。     

河南省及周边地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

为了解河南及周边地区猪圆环病毒2型(PCV2)的分子流行病学情况,运用PCR方法对2014—2015年采集到的河南及周边地区山东、山西、河北、甘肃5省共158份病料进行PCV2检测,将PCR扩增得到的PCV2 ORF2基因片段进行测序,分析研究PCV2遗传变异情况。结果显示,158份样品中,有69份样品为PCV2阳性,得到19株病毒的ORF2基因序列;将检测到的PCV2 ORF2序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸序列的同源性为89.9%~99.9%,其氨基酸序列同源性为88.0%~99.6%。综上可知,河南及周边地区PCV2流行广泛,病毒变异频繁。     

广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5 基因遗传变异分析

【目的】监测 2021 年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV) 的分子流行动态,为 PRRSV 综合防控措施的制定提供参考。【方法】在广东省内不同 地区 PRRSV 检测为阳性的 37 个规模猪场采集 521 份患病猪组织样本进行 PRRSV 检测。对样本进行 ORF5 基因 测序,采用 DNAStar 分析 ORF5 核苷酸的同源性及其推导氨基酸的同源性,并用 Mega7.0 构建基于 ORF5 基因的 系统遗传进化树。【结果】从 37 个猪场采集的样品 PRRSV 阳性率为 24.4%,猪场阳性率为 45.9%。通过测序分 析获得 17 株来自不同猪场的 PRRSV ORF5 基因序列,遗传进化分析表明所有毒株均属于北美毒株（PRRSV 2）, 其中有 5 株属于 Lineage 8( JXA1-like 和 CH-1a-like）谱系,9 株属于 Lineage 1( NADC30-like 和 NADC34-like）谱系, 3 株属于 Lineage 3（QYYZ-like）谱系,没有监测到 Lineage 5（VR2332-like）谱系的毒株。17 株 PRRSV 毒株的 ORF5 基因之间核苷酸序列同源性为 81.3%~99.5%,推导的氨基酸序列同源性为 80.0%~98.3%。【结论】2021 年 广东省 PRRSV 流行株以 Lineage 1（NADC30-like 和 NADC34-like）和 Lineage 8（JXA1-like 和 CH-1a-like）谱 系为主,占比分别为 52.94% 和 29.41%,Lineage 3（QYYZ-like）谱系降为次要流行株,占比为 17.65%。     

2010-2012年陕西地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查

【目的】调查陕西地区猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的分子流行病学变化趋势,为进一步预防和治疗猪圆环病毒病提供参考。【方法】于2010-2012年采集陕西西安、咸阳、宝鸡、榆林和延安等地区发病猪群中的141份样品。首先,采用PCR检测样品中PCV2感染情况;然后,通过基因型特异的PCR,检测PCV2阳性样品中PCV2a和PCV2b亚型的感染情况;最后,扩增、克隆和测序PCV2 ORF2基因编码序列,并通过生物信息学软件统计分析所获得基因序列的进化情况。【结果】141份样品中,117份检测为PCV2阳性,阳性率达82.9%,其中的33份病死猪样品中有32份检测为PCV2阳性。基因型特异的PCR检测结果显示,117份PCV2阳性样品中单感染PCV2b的为59份,单感染PCV2a的为11份,另外47份样品为PCV2a和PCV2b混合感染。对32份病死猪PCV2阳性样品的PCV2 ORF2基因序列进行比对分析,结果表明,12份为PCV2b-1A/1B亚型,16份为PCV2b-1C亚型,4份为PCV2a亚型。对各亚型ORF2氨基酸序列的分析结果表明,氨基酸的变异位点主要存在于8-47,59-101,134-169,180-210这4个区域。【结论】陕西地区猪群PCV2感染严重,并且PCV2b-1A/1B和PCV2b-1C亚型是主要流行毒株,氨基酸变异位点主要存在于Cap蛋白潜在表位区。     

猪圆环病毒2型快速直接PCR检测方法的建立与流行病学调查

为了解河南省猪圆环病毒2型(PCV2)的流行病学情况,参考Gen Bank的PCV2 ORF2的序列,设计1对引物,建立PCV2的快速直接PCR检测方法,并进行特异性和敏感性试验。运用该方法对2016年5月至2017年5月采集到的河南省共125份疑似猪圆环病毒2型的病料进行PCV2检测,阳性样品测序,分析河南省PCV2的遗传变异情况。结果显示,建立的PCR检测方法快速、特异、敏感,适用于临床检测或流行病学调查;所检测的125份样品中,55份样品为PCV2阳性,阳性率高达44%。阳性结果序列分析显示,核苷酸序列同源性在88.7%~99.8%,42份在PCV2b基因群。结果表明,河南省PCV2感染率较高,PCV2b为流行血清亚型,病毒变异严重。     

东南地区猪圆环病毒2型检测及分子流行病学分析

【目的】分析我国东南地区2012－2018年规模化猪场猪圆环病毒2型（PCV2）的流行动态、基因组特性及病毒重组情况,为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）的防控和疫苗开发提供理论依据。【方法】对2012-2018年采自福建、江西、广东、江苏及浙江等省规模化猪场疑似断奶仔猪多系统衰弱综合症（PMWS）猪只的649份组织样本及血清样本采用PCR方法进行检测,对PCV2进行基因分型,并选取54份阳性样品进行PCV2全基因组同源性比对、系统发育分析和重组分析,同时对ORF2基因进行遗传进化分析和衣壳（Cap）蛋白氨基酸序列比对。【结果】东南地区猪场感染PCV2较普遍,PCV2阳性率为41.9%（272/649）。猪场存在PCV2a、PCV2b、PCV2d和PCV2e 4个基因型毒株,其中以PCV2d流行为主。基于PCV2全长核苷酸序列和ORF2基因的系统进化分析表明,54株PCV2毒株均分为4个基因型; PCV2e毒株检出率较低（仅为0.46%）,其基因组全长1 777 bp,与其他基因型代表毒株的全长核苷酸同源性较低（91.0%~93.0%）。重组分析表明,不同基因型毒株间存在重组现象。Cap蛋白的氨基酸序列分析表明,不同基因型具有特征性的突变位点。【结论】东南地区猪场存在4种基因型PCV2,其中PCV2d为优势基因型,不同基因型毒株间存在重组现象。新基因型PCV2e的检出率较低。     

广西猪圆环病毒2型的遗传进化分析

【目的】了解广西各地当前流行的猪圆环病毒2型（PCV2）基因型差异、出现的时间、致病性及其今后流行趋势。【方法】根据GenBank中已发表的PCV2核苷酸全序列设计1对引物,从广西不同市（县）采集的猪组织样本（脾脏、肺脏、淋巴结、流产胎儿）中成功克隆获得34株PCV2 ORF2基因序列,并对其进行遗传进化分析。【结果】获得的34株PCV2中有9株ORF2基因全长为705bp,1株为696bp,其余的为702bp;经遗传进化分析,发现PCV2可以分为PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e5个基因型,在34株PCV2ORF2基因中,有7株属于PCV2d型,1株属于PCV2e型,25株属于PCV2b型,未发现PCV2a和PCV2c型,而新发现的GXHP-2不归属于任何一个基因型。【结论】广西目前流行的PCV2有PCV2b、PCV2d、PCV2e3个基因型,其中以PCV2b为主。     

广西PRRSV、PCV、CSF的混合感染及PRRSV分子病原学研究

为了弄清2007年发生于广西一些县市猪场的高致病性猪繁殖与呼吸综合征和其他疾病的混合感染情况,从广西7个县市发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征的猪场采集病料,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV)及猪瘟病毒(CSF)检测,并对检测的PRRSV进行分子病原学分析。结果显示,经PCR检测,86份样品中有60份为PRRSV阳性,36份为PCV阳性,2份为CSF阳性,说明发生于广西猪群的PRRSV与PCV共感染情况比较严重。通过PRRSVORF5基因序列比较分析发现,来自广西7个县市不同猪场的PRRSV高度同源,核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,推导编码的氨基酸序列同源性为98.0%~100.0%;与VR2332和LV株的核苷酸序列同源性分别为88.7%~89.7%和62.2%~63.1%,氨基酸序列同源性分别为88.6%~89.6%和60.5%~61.3%,表明7个县市不同毒株的ORF5基因区域变异不大,均属美洲型。     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学研究

 【目的】确定新疆南疆猪养殖场是否存在PRRSV感染,以及感染的PRRSV毒株类型及基因特点,从而针对性的有效防制PRRS。【方法】设计7对引物,对疑似PRRS发病猪场组织样品进行RT-PCR、克隆、测序和序列分析。【结果】47例样品,35例PRRSV阳性,阳性率高达74.47%（35/47）;35株均为美洲型毒株,其中有10株属于高致病性PRRSV,占总检测样品的21.28%（10/47）,占阳性样品的28.57%（10/35）;综合分析本研究采集样品猪养殖场不存在欧洲型毒株。【结论】新疆南疆存在美洲型PRRSV感染,且存在高致病性毒株。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV）3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCVB JC3株中扩增出与试验设计相符的286bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCVBJC3株细胞毒的敏感度达到2TCID50;对10份EMCVB JC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

猪脑心肌炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV） 3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCV BJC3株中扩增出与试验设计相符的286 bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCV BJC3株细胞毒的敏感度达到2 TCID50;对10份EMCV BJC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因克隆与序列分析

[目的]掌握新疆南疆PRRSV流行毒株特点,为新疆南疆PRRS的有效预防和控制提供理论依据。[方法]研究利用克隆和测序获得了8个新疆南疆PRRSV ORF5基因全序列,并进行序列分析。[结果]8个新疆南疆PRRSV ORF5基因长度均为603 bp,它们之间核苷酸同源性为87.4%～100.0%;与欧洲型代表株LV、美洲型代表株ATCC VR-2332、中国代表株CH-1a和中国HP-PRRS代表株JXA1核苷酸同源性分别为60.9%～63.5%、88.4%～89.9%、88.9%～94.7%和87.4%～98.7%;与中国猪养殖场常用的几种弱毒疫苗株核苷酸同源性为87.4%～94.7%;与美洲型毒株和欧洲型毒株氨基酸同源性为84.5%～98.0%和50.0%～59.5%。[结论]研究的8株新疆南疆PRRSV株均属于美洲型亚群Ⅱ毒株。利用新疆南疆PRRSV分子流行病学调查结论,可为新疆南疆PRRS防制疫苗的选择等做进一步的调整或指导奠定基础。     

建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒

 【目的】建立同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的环介导间接PCR方法，实现3种病毒快速检测。【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3对特异性探针，利用PCR技术分别标记于大豆Lectin基因片段的两端形成3种不同的报告基因，此标记的报告基因与3种待测靶标基因经杂交、缺口补平、环化后，采用1对引物反向PCR扩增报告基因，建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法，扩增片段大小分别为564 bp、434 bp和338 bp，该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性试验结果表明，无论是单病毒检测还是多病毒检测，该法都具有高度特异性，与其它病原检测无明显交叉反应；对PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒同时检测的底限分别为0.8、25和6.2 pg•μL-1，和单个病毒的检测灵敏度相同。利用环介导间接PCR和常规PCR对20份临床样本进行比较检测，结果表明，无论单病毒检测还是多病毒检测,其结果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3种病毒的同时检测，是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析(英文)

[目的]对来自2008～2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。[方法]利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。[结果]260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品,阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明,本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型,与GenBank中高致病性PRRSV(HP-PRRSV)参考毒株的氨基酸同源性为94.6%～100%,并可分为5个亚群,亚群III与HP-PRRSV同源性最高,几乎所有的亚群中和表位(primaryn eutralizing epitope,PNE)都存在变异,亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008～2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省,进化树分析结果表明,病毒的分型并没有呈现明显的地域性。[结论]2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染,PRRSV流行株为HP-PRRSV,其遗传演化相对稳定,但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,虽然亚群IV和V只出现在部分省市,但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。     

中国部分地区2005－2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

 【目的】为分析2005－2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特征，了解其遗传演化规律，查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005－2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒，应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型 PRRSV，ORF5基因全长均为603 bp，未发现有基因缺失或插入，编码约200个氨基酸，分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSV Nsp2基因全长为2 940 bp，21株PRRSV Nsp2基因全长为2 850 bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失，共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSV ORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析，系统进化关系显示，除B02-2005株可能与疫苗株有关外，多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近，不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析，发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群，以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的２亚群。进化关系表明PRRSV ORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异，不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象，地域特征不明显。