泥鳅elovl2和elovl5基因克隆、表达及其延长活性分析

为探究泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)脂肪酸延长酶2和延长酶5基因(elovl2,elovl5)在长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)合成中的作用,克隆获得泥鳅elovl2和elovl5基因cDNA全长序列,分析其在泥鳅不同组织中的表达规律;通过酵母体外表达验证其延长活性;并投喂以鱼油(FO)、亚麻芥油(CO)和大豆油(SO)为脂肪源的饲料8周,分析不同脂肪源对泥鳅elovl2和elovl5表达的影响。结果显示,泥鳅elovl2和elovl5的开放阅读框(ORF)分别为888bp和876bp,编码295和291个氨基酸。系统进化树分析表明泥鳅ELOVL2、ELOVL5和斑马鱼的同源性最近。序列比对分析ELOVL2和ELOVL5保守性较高,都具有长链脂肪酸延伸酶的特殊结构。泥鳅elovl2和elovl5均在肝组织中表达量最高。酵母功能验证结果表明泥鳅ELOVL2主要延长C20-22PUFA,而ELOVL5主要延长C18-20PUFA,对C22PUFA没有延长作用。不同饲料脂肪源投喂试验结果显示,CO组泥鳅肝脏和肌肉n-3PUFA含量显著上升,肌肉20∶5n-3含量显著升高,但肝脏和肌肉22∶6n-3含量没有显著变化。CO组泥鳅肝组织中elovl2、elovl5、scd和srebp-1c的表达量也显著上升。综上所述,泥鳅ELOVL2和ELOVL5在LC-PUFA合成中具有重要作用,饲料中CO添加可促进泥鳅n-3PUFA的积累。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的c DNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

薄荷GPPS基因的克隆与表达分析

牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS Geranyl diphosphate synthase)为短链异戊烯基合酶家族成员,催化1分子的IPP与DMAPP形成GPP,为单萜提供碳骨架。实验从我国薄荷品种"738"中克隆了GPPS大小亚基cDNA全长序列,对其进行序列分析,并研究GPPS基因在薄荷根、茎、叶、花中的相对表达量。结果:GPPS大亚基cDNA序列ORF全长1131 bp,编码377个氨基酸,GPPS小亚基cDNA序列ORF全长942 bp,编码313个氨基酸。研究获得的GPPS基因所编码氨基酸与薄荷属其他种的GPPS氨基酸序列高度相似。GPPS大亚基基因在薄荷品种"738"不同组织中均有表达,幼叶中的表达量最高。     

2个大豆RNA依赖的RNA聚合酶基因GmRDR6a和GmRDR6b的克隆与分析

利用同源克隆的方法从大豆品种‘科丰一号’中分离出2个RDR6基因,分别将其命名为GmRDR6a和GmRDR6b基因,并对其进行序列分析、植物组织表达以及抗逆境胁迫表达分析。结果表明:GmRDR6a基因位于大豆基因组的6号染色体上,基因全长为4 389 bp,包含一个长度为744 bp的内含子,其ORF长度为3 615 bp,编码1 204个氨基酸,相对分子质量和等电点分别为297.5×103和4.86;GmRDR6b基因位于大豆基因组的4号染色体上,基因全长为4 002 bp,包含一个长度为387 bp的内含子,其ORF长度为3 615 bp,编码1 204个氨基酸,相对分子质量和等电点分别为296.89×103和4.86;GmRDR6a和GmRDR6b都含有RDRs家族的保守序列DLDGD;2个基因在所有被检测组织中均表达,并且在花中的表达量最高;荧光定量结果表明:在大豆花叶病毒(SMV)处理下,2个基因在抗病材料‘科丰一号’中的表达量均显著高于感病材料‘南农1138-2’,在非生物胁迫下,GmRDR6a基因在盐和干旱处理下根、茎、叶组织中的表达量均提高,其中盐处理下根中的表达量最高,ABA诱导条件下出现早期响应,但是在冷害处理下该基因的表达量没有明显变化;GmRDR6b基因在盐、ABA处理下,表达量很高,冷害处理下出现早期响应,但是在干旱条件下,该基因表达趋势不明显。     

葡萄中白藜芦醇合成酶基因的克隆及其转化黄芪研究

利用RT-PCR技术从巨峰葡萄中克隆获得RS基因的全长c DNA序列,并利用农杆菌侵染法转化黄芪。试验结果表明:经Vector NTI 11.0软件分析克隆获得的RS基因全长序列长度为1 241 bp,并带14 bp长度的poly(A)尾巴,包含930 bp的开放读码框(ORF),编码1个含310个氨基酸残基的蛋白质。生物信息学分析结果表明:RS基因编码白藜芦醇合成酶,对RS基因全长序列进行蛋白质结构域分析,证明该基因具有查尔酮合成酶N端保守结构域,其长度为225个氨基酸。对黄芪进行遗传转化结果表明:获得了3棵黄芪转基因阳性植株,通过DNA、RNA以及蛋白质水平证明RS基因已经完全整合到黄芪基因组中并表达。     

日本囊对虾apo-14基因的全克隆及序列分析

以日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)肝胰腺组织为实验材料,提取总RNA,通过3′以及5 '-RACE基因克隆技术,首次在日本囊对虾中克隆到载脂蛋白apolipoprotein-14(apo-14)基因的全长序列,包含完整的ORF以及3′-UTR和5′-UTR.日本囊对虾apo-14 cDNA序列全长为784 bp,其中ORF长度为420 bp,编码139个氨基酸.对虾apo-14氨基酸序列与其他鱼类apo-14氨基酸序列有较高的相似性.     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列分析及原核表达

对斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列特征及原核表达进行了初步研究.ORF56基因编码区全长675 bp,编码224个氨基酸,预测编码蛋白分子量25.9 ku.序列分析显示,ORF56具有典型的晚期启动子特征序列GTAAG,推导的氨基酸序列中含有13个磷酸化位点和3个N-糖基化位点.PCR扩增获得该基因,克隆到融合表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21中诱导表达.用纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,为深入研究SpltMNPVⅡORF56的结构与功能提供基础.     

泥鳅cyp19a1基因克隆及其在倍性间的表达差异

克隆并分析泥鳅cyp19a1a的全长cDNA和5′侧翼序列,用qRT-PCR技术比较cyp19a1a在二倍体、四倍体泥鳅组织间和倍性间的表达差异。结果发现,泥鳅cyp19a1a的cDNA全长1 905 bp,包括29 bp的5′TR、301 bp的3′UTR和1 575 bp的ORF序列,其氨基酸序列中存在I-螺旋区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区等重要功能域。用hiTAIL-PCR克隆获得2 040 bp的5′侧翼序列,在该序列上预测到典型元件TATA-box,以及C/EBPβ、SRY、ER、CREB、GR等转录因子结合位点。12月龄四倍体泥鳅的体长、体质量均显著高于二倍体,但性腺发育明显滞后于二倍体。cyp19a1a和cyp19a1b分别在二倍体、四倍体泥鳅的性腺和脑中的表达量最高。倍性间比较结果显示,cyp19a1a在四倍体各组织中的表达均高于二倍体(除精巢外);cyp19a1b在四倍体雌鳅脑中的表达量显著高于二倍体,但在四倍体雄鳅脑中的表达量显著低于二倍体。综合分析上述结果,四倍体中相对较高的cyp19a1a表达可能与其性腺所处发育时期有关,较晚的性成熟有利于泥鳅将更多能量用于个体生长。由于cyp19a1及其催化产生的雌激素还可以通过GH-IGF通路调节鱼类的生长,推测cyp19a1在泥鳅倍性间的差异表达可能与二倍体、四倍体间的生长生殖差异密切相关。     

如皋火腿酯类物质氧化和水解分析

为了研究如皋火腿中的酯类物质。选取7条4.5~5.0 kg如皋火腿为试材,用常规方法测定其理化指标(水分、盐分和pH值),通过气相色谱测定从提取脂质中分离的游离脂肪酸含量,并测定其共轭二烯值与羰基值。在如皋火腿股二头肌和皮下脂肪中含盐量为11.60%和1.07%,水分为40.21%和3.65%,pH值为5.71和6.02,游离脂肪酸含量为49.65%和26.11%,除pH外均存在极显著差异。如皋火腿中含有丰富的游离脂肪酸,在皮下脂肪中油酸的含量最多,股二头肌中亚油酸的含量最多。火腿中存在少量的反式脂肪酸,皮下脂肪有反式的油酸,股二头肌中有反式油酸、亚油酸和亚麻酸。股二头肌的氧化明显高于皮下脂肪,可能与酶活力、氧化方式有关。     

广西不同产地核桃含油率和脂肪酸组分研究

为了解广西核桃种仁含油率和脂肪酸组分含量差异，以巴马、凤山、天峨、南丹、乐业、田林、隆林等7个县份筛选的优树果实样品共计31个为研究对象，测定分析了果实含油率和脂肪酸组分含量。结果表明：种仁含油率为56.9%~65.1%，其中凤山004含油率最高，为65.1%，其次南丹004为64.1%，凤山002含油率最低。测定了广西不同产地核桃种仁的棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸和油酸等5种脂肪酸组分，其中棕榈酸含量在4.09%~8.36%，硬脂酸10.57%~45.09%、亚油酸45.88%~77.26%、亚麻酸3.16~10.28%、油酸0.3%~2.44%。以果实含油率及脂肪酸组成来评价不同产地核桃，为核桃产地的地区品牌打造的依据。     

日粮添加不同脂肪酸混合物对奶牛血液脂肪酸组成及抗氧化性能的影响

研究日粮添加不同脂肪酸混合物对泌乳奶牛血液脂肪酸组成及抗氧化性能的影响,选用36头健康的荷斯坦奶牛平均分为3个处理组,分别为对照组、长链脂肪酸组（LCFA）和中短链脂肪酸组（SMCFA）,试验期8周,结果表明,泌乳奶牛日粮添加中短链脂肪酸可以显著降低血浆中碳链长度大于16的脂肪酸和总不饱和脂肪酸的含量（85.1%和87.94%;P〈0.05）,显著提高血浆中碳链长度小于等于16的脂肪酸和总饱和脂肪酸的含量（14.86%和12.13%;P〈0.05）。同时,日粮添加中短链脂肪酸显著提高血浆中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比值（0.41%和0.36%;P〈0.05）,显著降低了血浆中不饱和脂肪酸的含量（P〈0.05）。而日粮添加长链脂肪酸对血浆中各类脂肪酸含量影响差异不显著。试验结果还发现,日粮中添加中短链脂肪酸显著提高了血清中谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性（P〈0.05）,降低了脂质过氧化产物丙二醛的含量,但没有达到显著水平。而日粮中添加长链脂肪酸也趋向于提高血清中谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性,但只有谷胱甘肽过氧化物酶达到了显著水平（P〈0.05）。同时日粮添加长链脂肪酸显著提高了血清中丙二醛含量（P〈0.05）。结果显示,中短链脂肪酸较长链脂肪酸提高了血液的抗氧化性能,降低了脂质过氧化产物的产生,但是会提高血液脂肪酸的总饱和度。     

脂肪酸去饱和酶参与植物对胁迫的响应

植物常受到温度、盐和干旱等非生物以及病原菌和昆虫等生物胁迫。全面了解脂肪酸的去饱和、动员和调控将有助于提高植物对非生物和生物胁迫的耐受性。文章对近年植物脂肪酸在去饱和、动员和调控非生物和生物胁迫上的研究进展进行综述,并对脂肪酸去饱和酶的调控进行讨论。     

日粮添加亚油酸和二十二碳六烯酸对奶牛瘤胃原虫奇数碳链脂肪酸和支链脂肪酸的影响

试验选取4头安装有永久性瘤胃、十二指肠和回肠瘘管的荷斯坦泌乳奶牛,采用4×4拉丁方试验设计,研究日粮中添加亚油酸(LA)和二十二碳六烯酸(DHA)对瘤胃原虫中奇数碳链脂肪酸和支链脂肪酸的影响.试验结果表明:奇数碳链脂肪酸和支链脂肪酸(OBCFA)是原虫脂肪酸的重要组成部分,与对照组相比,日粮中单独添加LA或DHA对瘤胃原虫中主要OBCFA的含量无显著影响,而当LA和DHA协同添加时C15∶0和C17∶0的含量显著降低(P0.05),但对异构酸和反异构酸的含量无显著影响.     

特殊脂肪酸生物合成的基因工程研究进展

脂肪酸是生物体的重要组成成分,对维持生物体的正常生命活动具有重要功能.在一些动植物或微生物中存在一些特殊脂肪酸,主要包括以下两类:一是通常在鱼油和海底微生物中发现的长链多不饱和脂肪酸,在医药保健业有重要应用价值;二是通常包含有羟基、环氧基或炔键等功能基团的脂肪酸,为重要的工业原料.本文综述了近年来几种特殊脂肪酸生物合成的基因工程研究进展.     

The effects of step-wise improvement of forage combination in total mixed rations on fatty acid profile in the rumen and milk of Holstein cows

Five lactating Holstein cows in a 5×5 Latin square experiment were fed five high-concentrate total mixed rations(TMRs) to investigate the effects of step-wise improvement of forage combination on ruminal and milk fatty acid profiles. The ratio of concentrate to forage was fixed as 61:39, and the step-wise improvement of forage combination was applied as: TMR1, a ration containing corn stover; TMR2, a ration containing corn stover and ensiled corn stover; TMR3, a ration containing ensiled corn stover and Chinese wild ryegrass hay(Leymus chinensis); TMR4, a ration containing the ryegrass hay and whole corn silage; TMR5, a ration containing the ryegrass hay, whole corn silage and alfalfa hay. The TMRs were offered to the cows twice daily at 0700 and 1900 h. The entire experiment was completed in five periods, and each period lasted for 18 days. Diurnal samples of rumen fluids were collected at 0100, 0700, 1300 and 1900 h(day 16); 0300, 0900, 1500 and 2100 h(day 17); and 0500, 1100, 1700 and 2300 h(day 18). The step-wise improvement of forage combination increased energy and crude protein contents and decreased fibre content. As a result, the step-wise improvement of forage combination increased dry matter intake and milk yield(P0.05). The step-wise improvement increased dietary content of linolenic acid(C18:3 n-3), but did not alter dietary proportions of palmitic acid(C16:0), stearic acid(C18:0), oleic acid(C18:1 cis-9), linoleic acid(C18:2 n-6) and arachidic acid(C20:0). In response to the forage combination, ruminal concentration of C16:0, C18:2 n-6 and C18:3 n-3 linearly increased against their dietary intakes(P0.10). The step-wise improvement increased milk contents of C10:0, C12:0, C14:0, C16:0, C18:2 n-6 and C18:3 n-3(P0.10) and decreased milk contents of C18:0 and C18:1 cis-9(P0.05). Milk yields of C16:0, C18:1 cis-9, C18:2 n-6 and C18:3 n-3 were linearly increased by the increase of these fatty acids in the rumen(R2≥0.79, P0.05), and milk yields of C18:2 n-6 and C18:3 n-3 were also positively correlated with dietary intake of these fatty acids(R2≥0.85, P0.05). The step-wise improvement increased the transfer efficiencies from feed to milk for C18:2 n-6 from 11.8 to 14.2% and for C18:3 n-3 from 19.1 to 22.3%. In a brief, along with the step-wise improvement of forage combination, more dietary linoleic and linolenic acids might escape microbial hydrogenation in the rumen and consequently accumulated in milk fat though these fatty acids were present in low concentrations in ruminal fluids. The step-wise improvement of forage combinations could be recommended as a dietary strategy to increase the transfer efficiency of linoleic and linolenic acids from feed to milk.     

不同绵羊品种脂肪组织中挥发性脂肪酸的组成分析

【目的】研究绵羊品种对其脂肪组织中挥发性脂肪酸(C4~C10)组成的影响,为深入研究羊肉膻味的形成机理奠定基础。【方法】采用同时蒸馏萃取和气相色谱技术,对小尾寒羊、滩羊和同羊皮下脂肪组织中的挥发性脂肪酸进行了定量分析。【结果】采用同时蒸馏萃取和气相色谱技术可在绵羊脂肪组织中检测到对羊肉膻味贡献较大的4-甲基辛酸和4-甲基壬酸。小尾寒羊、滩羊和同羊的总挥发性脂肪酸含量分别为261.109,169.124和271.898mg/kg;其中直链脂肪酸含量分别为217.792,143.036和229.059 mg/kg,支链脂肪酸含量分别为43.317,26.088和42.839 mg/kg。4-甲基辛酸和4-甲基壬酸是对羊肉膻味贡献较大的挥发性脂肪酸,其在小尾寒羊、滩羊、同羊脂肪组织中的含量分别为20.317和9.772,14.150和5.597,12.835和6.403 mg/kg。【结论】应用此方法可以检测到对羊肉膻味有主要作用的挥发性脂肪酸,且不同绵羊品种对其脂肪组织中挥发性脂肪酸的组成有一定影响,小尾寒羊脂肪组织中4-甲基辛酸和4-甲基壬酸含量有大于滩羊和同羊的趋势。     

6种油脂和大豆粉、菜籽粉氧化指标及其脂肪酸组成的变化

在人工氧化条件下,测定猪油、豆油、大豆粉、菜籽油、菜籽粉、江苏棉籽油、新疆棉籽油、罗非鱼油的酸价、碘值、过氧化值、丙二醛、脂肪酸组成。结果表明:①罗非鱼油所测定的氧化指标变化较其它油脂明显,其氧化稳定性最差;②猪油、罗非鱼油、棉籽油、菜籽油、豆油在氧化过程中过氧化值(POV)变化明显,应该成为油脂氧化程度评价的通用性指标;③大豆粉和菜籽粉的氧化指标变化最小,且其氧化稳定性明显好于相应的油脂;④0～70h内,随着氧化时间的延长,各油脂的脂肪酸组成有一定的变化。结论:在氧化过程中,不同种类油脂的氧化指标敏感度有差别,评价油脂氧化程度时应根据油脂种类选择氧化指标进行评价;在油脂氧化初期阶段,用脂肪酸的组成变化来表征油脂在氧化过程中品质的变化现象并不明显。