腺病毒载体的研究进展

叙述了腺病毒的生物特性、腺病毒载体的发展进程和构建策略、在动物疫苗研究中的应用及其优势,同时阐述了腺病毒载体遇到的免疫学问题,并对腺病毒载体进行了展望,随着动物腺病毒载体的发展,它必将在控制人和动物传染病,特别是在病毒性传染病中发挥越来越重要的作用。     

腺病毒在动物口蹄疫防治中的研究进展

由于腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合到动物宿主细胞染色体等优点,已被认为是最有效的转基因载体之一,成为重组疫苗和基因治疗研究的热点。本文就腺病毒载体的生物学特性、研究进展及在口蹄疫防治中发挥的重要作用进行综述。     

腺病毒载体研究进展与展望

腺病毒载体具有高效传递和表达基因的能力(尤其是在体外),在过去的15年里已经得到充分地证实。腺病毒载体由于宿主范围广泛和对人体的低致病性、病毒颗粒比较稳定、基因组较少发生重排等优点,已经成为最常用的病毒载体之一。但由于细胞的靶向性和宿主的免疫反应限制了腺病毒载体的应用和发展,为此,对腺病毒载体进行了不断改进和完善,其潜在的应用价值也得到了广泛关注。现就对腺病毒载体的特点,改进和应用方面的研究进展综述如下。     

腺病毒载体在基因治疗研究中的应用

近年来腺病毒载体以操作方便、滴度高、安全性好等优点,已经成为基因治疗研究的热点。介绍了腺病毒的结构特点,利用重组腺病毒载体进行基因治疗的原理,腺病毒载体在基因治疗中的应用等。并对腺病毒载体的发展趋势和存在问题进行了阐述。     

猪腺病毒感染

猪腺病毒感染大多数是无临诊症状的,但有时也可引起脑炎、肺炎、肠炎、肾病理变化或呼吸道疾病。1964年美国首次从腹泻猪直肠拭子中分离到猪腺病毒,1966年从患脑炎的仔猪脑中分离到腺病毒,以后从各种病料中都分离出该病毒。血清学调查表明,猪的腺病毒感染分布广泛,可以广泛存在。根据中和试验迄今共发现6个血清型,其中血清4型分布最为广泛,且能凝集多种动物的红细胞。1病原猪腺病毒的基本特性与腺病毒科的其他成员相似。它们在pH4或用氯     

表达狂犬病毒糖蛋白和核蛋白的重组腺病毒的生物学特性及免疫研究

对狂犬病毒G+N双基因复制缺陷型腺病毒穿梭载体进行转染,以获得融合表过狂犬病毒糖蛋白和核蛋白重组腺病毒,并对其进行生物学特性和免疫学研究.结果表明:将含有狂犬病毒G+N的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/G+N与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌细胞内同源重组,可获得带有目的基因的重组腺病毒载体pAd/G+N,经PacI酶切后转染HEK-293细胞,可获得带有目的基因的重组腺病毒.重组腺病毒在HEK-293细胞中连续传代15代次后,在细胞内的病变时间缩短为20 h以内.经测定,重组腺病毒对HEK-293细胞的TCID50为10-8.0.mL-1,用RT-PCR法可检测到狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段;重组腺病毒经口服免疫小白鼠,对狂犬病毒CVS毒株的免疫保护率可达80%.     

腺病毒载体的研究进展

目前,腺病毒载体已成为基因治疗和重组疫苗研究的热点,是基础研究、基因治疗和重组疫苗开发等领域中的重要工具。本文就腺病毒载体的结构、构建、应用和改进方面的研究进展作一综述。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。     

新时期人畜共患病的公共卫生意义

随着疫病诊断技术的提高和人类探索大自然的深入，以及病原微生物的不断进化，使旧的动物源性疫病不断再现，新的动物源性疫病不断发生。遵循人畜共患病控制的新理念，将人畜共患病控制放在疾病侵袭人类之前。要提高对动物在人畜共患病防控中的认识，强调在防控人畜共患病中，动物卫生和疫病的控制对人类疫病的防控发挥着重要作用。在人畜共患病中动物的作用可能是疫病发生、发展环节中的源头，是起始点，也是终点。没有动物病原的有效控制和净化，人类就很难控制和净化自身，应该看到在防控人畜共患病中人和动物同等重要，有时动物的问题可能更突出一些。研究人畜共患病控制对策，就要提高疫病诊断能力，增强疫苗研发能力。     

农村畜牧卫生防疫工作的重要性及措施

通过对农村动物防疫工作中存在问题的分析,阐述了加强农村动物防疫工作,有效预防和控制动物疫病,不仅是畜牧业健康发展的重要手段和重要保障,还是维护食品安全、畜产品贸易和人类健康的需要,是加快畜牧业发展的前提条件,也是保护和增进人类健康及财产安全的重要措施。同时,提出了兽医卫生防疫工作的发展对策和措施。     

噬菌体在水产养殖中应用的研究进展

近年来,我国水产养殖业发展迅猛,带来巨大收益的同时,抗生素和化学药物的长期滥用也产生了污染环境、耐药性差和威胁食品安全等诸多问题。亟待寻求一种既能有效控制海水养殖动物疾病、又环境友好的新技术、新产品,以部分或完全替代抗生素或化学药物。噬菌体是一种安全、高效、无毒无害、生态友好的疾病防治绿色产品,相继在陆生和水产动物疾病防治中应用。介绍了噬菌体生物学、噬菌体治疗及噬菌体在水产养殖业中的应用等最新研究进展,展望了噬菌体防治水产养殖病害的前景,以期为噬菌体治疗水产养殖疾病提供理论和技术支持。     

Identification of a conserved receptor-binding site on the fiber proteins of CAR-recognizing adenoviridae

The human adenovirus serotype 5 (Ad5) is used widely for applications in human gene therapy. Cellular attachment of Ad5 is mediated by binding of the carboxyl-terminal knob of its fiber coat protein to the Coxsackie adenovirus receptor (CAR) protein. However, Ad5 binding to CAR hampers the development of adenovirus vectors capable of specifically targeting (diseased) tissues or organs. Through sequence analysis and mutagenesis, a conserved receptor-binding region was identified on the side of three divergent CAR-binding knobs. The feasibility of simultaneous CAR ablation and redirection of an adenovirus to a new receptor is demonstrated.     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因腺病毒载体的构建及包装

【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造，依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体，将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到 BJ5183 细菌中进行重组，经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后，转染HEK293人胚肾细胞，培养7 d后，收集细胞并反复冻融，收集细胞裂解液；反复扩增3次后，测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-hTERT；②通过同源重组将外源目的基因hTERT整合到腺病毒骨架载体中，得到重组质粒pAdEasy-hTERT；③成功获得了滴度为6.73×10¹⁰ GFU/mL的高滴度腺病毒颗粒。【结论】含有hTERT基因的重组腺病毒颗粒包装成功，为后续哺乳动物原代细胞永生化研究奠定了基础。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

基因治疗及其在兽医学中的应用

基因治疗是20世纪90年代形成的，该技术的研究一开始就与动物医学的发展密不可分，主要是通过建立动物疾病模型分析和研究基因治疗各种层面上的问题，但它真正在兽医临床上的研究是近年才开始的。许多试验结果表明，一旦载体的安全性有了保障，基因治疗将有可能成为动物重大疫病有效预防和治疗的方法，在兽医学中有很广阔的应用前景。