2D-DIGE技术研究自交不亲和杏品种‘新世纪’花柱表达蛋白

 【目的】从蛋白质组水平探索杏树自交不亲和的分子遗传机制。【方法】采用双向差异凝胶电泳和质谱检测技术,对自交不亲和杏品种‘新世纪’在小蕾期、大蕾期、自花授粉后24 h及异花授粉(‘新世纪’ב巴旦水杏’)后24 h的花柱进行差异性蛋白质组学研究。【结果】在‘新世纪’杏的小蕾期、大蕾期、自花授粉后24 h、异花授粉24 h后的花柱中共检测到约1 500个蛋白点,其中有66个差异表达的蛋白点。自交不亲和杏柱头对自体与异体花粉感应在蛋白质组水平有差异,其中异花授粉后花柱中特异表达的蛋白点1个,异花授粉后表达丰度明显升高的蛋白点4个,表达丰度明显降低的蛋白点29个;质谱分析只有13个蛋白质点得到归属鉴定。【结论】明确‘新世纪’杏花花柱对自体与异体花粉感应在蛋白质组水平上有差异。     

软枣猕猴桃受精后子房蛋白表达的2D-DIGE分析

【目的】了解软枣猕猴桃(Actinidia arguta)受精前和受精后（授粉前和授粉后120 h）子房蛋白质组的变化,为阐明猕猴桃属植物双受精的分子机制提供依据。【方法】应用石蜡切片技术、差异凝胶电泳（DIGE）、质谱（MALDI－TOF/TOF）和生物信息学技术,对其授粉前及授粉后120 h的子房形态及蛋白质组变化进行分析。【结果】授粉后120 h,子房中的胚囊已经完成了双受精;用DeCyder V 6.5软件分析,在授粉前、授粉后120 h的子房中共检测到约1 500个蛋白质点,其中55个有差异表达;质谱鉴定了差异2.0倍以上的蛋白质点13个,其中8个获得理想结果,分别属于6种蛋白质;在6种差异蛋白质中,其中5种在授粉后子房中表达上调,只有1种表达下调。【结论】根据软枣猕猴桃受精前后子房差异蛋白表达谱比较,获得了几种与双受精过程相关的蛋白质分子。     

玉米杂交种与亲本苗期叶片差异表达蛋白谱分析

【目的】建立玉米杂交种与亲本苗期叶片差异表达蛋白谱,探讨叶片大小杂种优势形成的分子机理。【方法】以玉米强优势杂交种Mo17/B73及其亲本发芽后第5天的第3片叶为材料,采用双向电泳技术（2-DE）,结合MALDI TOF MS质谱技术,建立叶片细胞分裂和生长关键区域的差异表达蛋白质谱,并对差异表达蛋白进行质谱鉴定。【结果】在检测到的630个蛋白质点中,有52个蛋白质点在杂交种与亲本之间的表达差异达到显著水平,表现为单亲沉默（15个）、偏高亲（13个）、偏低亲（8个）、杂种上调（6个）、杂种下调（7个）和杂种特异表达模式（3个）。另外,还成功鉴定出了其中的28个差异表达蛋白质点,涉及到代谢、胁迫响应、糖酵解、转录调控、蛋白折叠和降解、三羧酸循环、细胞骨架、发育及未知蛋白质等9个功能类别。【结论】玉米杂交种与亲本在蛋白丰度上存在明显的差异,并且差异表达蛋白涉及到多个功能类别,可能与玉米叶片大小杂种优势的形成有关。     

玉米诱变与原自交系株高变化的蛋白质组学及差异基因的功能分析

【目的】研究玉米经EMS处理后诱变系与原自交系的蛋白表达机制,为从蛋白质组学角度揭示诱变后选育材料在株高发生变化及生物产量明显提高等方面的分子理论奠定基础。【方法】以玉米(Zea mays L.)优良自交系AMD16和诱变后选育材料为试材,采用双向电泳、质谱分析以及检索技术,比较选育材料与原自交系叶片蛋白质组的差异,并对其候选基因进行分离、克隆,构建植物表达载体p3300-ZmMDH6,最后进行拟南芥的遗传转化与鉴定。【结果】EMS诱变后选育材料的蛋白质组中出现21个差异蛋白质点,其中5个蛋白质点在选育材料中特异表达,1个蛋白质点下调表达,7个蛋白质点上调表达,有2个差异蛋白质点在原自交系中表达,而未在选育材料中表达。通过MALDI-TOF-MS质谱测序和MASCOT序列分析,鉴定出了15个差异表达蛋白质点,其功能涉及生物细胞代谢/能量代谢、防御/抗胁迫、细胞蛋白合成和叶绿素合成等细胞过程。用RT-PCR方法克隆了其候选基因ZmMDH6的编码区cDNA,长度1 296bp,由432个氨基酸残基组成,分子质量46.80ku,等电点5.79;并构建植物表达载体进而转化拟南芥,经检测证明已获得T1代转基因植株。【结论】玉米诱变系与原自交系在蛋白丰度上存在明显的差异;差异表达蛋白涉及到各个生长发育过程,可能与玉米生物产量的提高和株高的改变有密切关系。     

甘蓝型油菜授粉功能缺失突变体及其 野生型柱头差异蛋白研究

【目的】基于蛋白质组学水平分析甘蓝型油菜野生型和授粉功能缺失突变体的柱头差异蛋白。【方法】运用双向电泳技术研究甘蓝型油菜柱头授粉功能缺失的突变体FS-M1及其野生型（宁油10号）柱头差异蛋白的表达,结合质谱（MALDI-TOF-TOF/MS）分析与蛋白质数据检索技术,鉴定甘蓝型油菜野生型柱头上调表达蛋白的性质和功能。【结果】获得了甘蓝型油菜野生型柱头显著上调且可鉴定的蛋白有33个,包括抗胁迫/防御、氧化还原反应平衡调节、碳水化合物代谢、蛋白质水解、蛋白折叠、氨基酸和氮代谢、核苷酸代谢等7类功能蛋白。【结论】甘蓝型油菜野生型柱头中上调表达蛋白功能广泛,这些表达蛋白可能与甘蓝型油菜柱头授粉功能的调控有关。     

原种意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）与其王浆高产品系工蜂蛹期头部发育差异蛋白质组分析#br#

【目的】对原种意大利蜜蜂（意蜂）和原种意大利蜜蜂的王浆高产品系（浆蜂）工蜂蛹期头部的蛋白质组进行比较,以探明浆蜂和意蜂3个日龄（13、15、17日龄）蛋白质表达调控方面的差异,为阐明蜜蜂发育生物学提供一定理论基础。【方法】采用双向电泳建立浆蜂和意蜂3个日龄蛹期头部蛋白质组表达谱,获得图谱中蛋白质的种类、表达量、等电点和分子量等信息,并通过质谱分析、数据库检索,鉴定部分差异蛋白。【结果】在13日龄蛹头部,浆蜂表达279个蛋白,意蜂表达268个蛋白,浆蜂和意蜂共有蛋白为212个,而浆蜂和意蜂的特异蛋白分别为67个和56个;到15日龄时,浆蜂表达296个蛋白,意蜂为277个,浆蜂和意蜂共有蛋白点为203个,浆蜂特异蛋白点为93个,意蜂特异蛋白点为74个;到17日龄蛹时,浆蜂蛋白质组有340个蛋白点,而意蜂则有279个蛋白点,浆蜂和意蜂共有蛋白点为246个,浆蜂的特异蛋白点为94个,意蜂特异蛋白点为33个。对部分差异蛋白质进行质谱分析后,鉴定出11个蛋白质。对已鉴定蛋白质表达量聚类分析,结果聚为2类：表达量上调的分别是微管蛋白、肌动蛋白88F、ATP合成酶、谷胱甘肽S-转移酶S1、精氨酸激酶、热激蛋白、蛋白酶体2亚基、泡液ATP合成酶催化亚基和转录起始因子5A;表达量下调的蛋白质为过氧化物氧化还原酶2 540。【结论】浆蜂经过蜂王浆高产的选育,表达的蛋白质种类比意蜂增加。随着日龄的增长,大多数与细胞骨架、抗氧化相关和代谢相关的蛋白质显著上调表达,表明工蜂蛹头部的王浆腺和唾液腺等组织在生长发育,新陈代谢加强以及神经系统逐渐重塑。这将对全面理解浆蜂和意蜂蛹期发育规律奠定基础。     

原种意大利蜜蜂(Apis mellifera L.)与其王浆高产品系工蜂蛹期头部发育差异蛋白质组分析

【目的】对原种意大利蜜蜂(意蜂)和原种意大利蜜蜂的王浆高产品系(浆蜂)工蜂蛹期头部的蛋白质组进行比较,以探明浆蜂和意蜂3个日龄(13、15、17日龄)蛋白质表达调控方面的差异,为阐明蜜蜂发育生物学提供一定理论基础。【方法】采用双向电泳建立浆蜂和意蜂3个日龄蛹期头部蛋白质组表达谱,获得图谱中蛋白质的种类、表达量、等电点和分子量等信息,并通过质谱分析、数据库检索,鉴定部分差异蛋白。【结果】在13日龄蛹头部,浆蜂表达279个蛋白,意蜂表达268个蛋白,浆蜂和意蜂共有蛋白为212个,而浆蜂和意蜂的特异蛋白分别为67个和56个;到15日龄时,浆蜂表达296个蛋白,意蜂为277个,浆蜂和意蜂共有蛋白点为203个,浆蜂特异蛋白点为93个,意蜂特异蛋白点为74个;到17日龄蛹时,浆蜂蛋白质组有340个蛋白点,而意蜂则有279个蛋白点,浆蜂和意蜂共有蛋白点为246个,浆蜂的特异蛋白点为94个,意蜂特异蛋白点为33个。对部分差异蛋白质进行质谱分析后,鉴定出11个蛋白质。对已鉴定蛋白质表达量聚类分析,结果聚为2类:表达量上调的分别是微管蛋白、肌动蛋白88F、ATP合成酶、谷胱甘肽S-转移酶S1、精氨酸激酶、热激蛋白、蛋白酶体2亚基、泡液ATP合成酶催化亚基和转录起始因子5A;表达量下调的蛋白质为过氧化物氧化还原酶2540。【结论】浆蜂经过蜂王浆高产的选育,表达的蛋白质种类比意蜂增加。随着日龄的增长,大多数与细胞骨架、抗氧化相关和代谢相关的蛋白质显著上调表达,表明工蜂蛹头部的王浆腺和唾液腺等组织在生长发育,新陈代谢加强以及神经系统逐渐重塑。这将对全面理解浆蜂和意蜂蛹期发育规律奠定基础。     

低温对不同基因型黄瓜叶片蛋白质组的影响

 【目的】分离不同基因型黄瓜叶片的低温诱导蛋白,为从蛋白质组角度揭示黄瓜应答低温逆境的调控机制打下基础。【方法】以黄瓜（Cucumis sativus L.）的日光温室品种‘新泰密刺’和露地栽培品种‘津研4号’为试材,采用分步提取法溶解叶片总蛋白质,运用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、质谱分析与检索技术,在100 μmol?m-2?s-1的光照条件下,比较研究低温（15/15℃）和常温（25/18℃）下叶片蛋白质组的差异。【结果】利用提取液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分步提取叶片总蛋白质后,提取液Ⅰ溶解的黄瓜蛋白质较少。对提取液Ⅱ和Ⅲ溶解的叶片蛋白质进行双向电泳后发现,相对于常温处理,低温使‘新泰密刺’的7个蛋白质点特异表达、2个蛋白质点上调表达、2个蛋白质点下调表达、5个蛋白质点未表达;使‘津研4号’的7个蛋白质点特异表达、1个蛋白质点上调表达、4个蛋白质点下调表达、9个蛋白质点未表达。低温下,‘新泰密刺’的蛋白质点3和4 以及‘津研4号’中蛋白质点2的表达量显著高于常温处理,通过MALDI-TOF质谱分析,这3个蛋白质点被鉴定为1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的大亚基。【结论】黄瓜叶片的高亲水性蛋白质含量低;在相同的光照（100 μmol?m-2?s-1）条件下低温对不同基因型黄瓜叶片的蛋白质组均有影响;1,5-二磷酸核酮糖羧化酶可能与黄瓜叶片耐低温有关。     

氮素对灌浆期夏玉米叶片蛋白质表达的调控

【目的】在大田生产条件下研究氮素对灌浆期玉米叶片蛋白质表达的调控。【方法】在大田生产条件下,以紧凑耐密型玉米杂交种登海618为试验材料,研究施氮对玉米穗位叶花后净光合速率、硝酸还原酶（NR）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量和可溶性蛋白含量的影响。采用TCA-丙酮沉淀法提取灌浆期（花后20 d）两个施氮处理下玉米穗位叶总蛋白质,并用双向凝胶电泳技术（2-DE）分离获得蛋白质图谱。采用ImageMaster-2D Elite 7.0图像分析软件对蛋白质图谱进行比较,确定玉米叶片应答灌浆期施氮处理的差异蛋白点。通过MALDI-TOF/TOF MS质谱分析及NCBInr数据库搜索,对差异表达蛋白质进行鉴定并分析其涉及的生物学功能。【结果】开花后,随生育进程的推进,玉米穗位叶净光合速率、叶绿素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均呈下降趋势,而MDA含量则呈上升趋势。相对于不施氮处理,施氮处理下叶片叶绿素含量、NR、SOD和POD活性及可溶性蛋白含量均显著提高,而MDA含量则显著下降。对灌浆期玉米叶片进行双向电泳及图谱分析,分别在施氮和不施氮条件下检测出1 086和1 170个蛋白点。通过图像分析软件进行成对匹配分析,共得到29个显著差异蛋白点。经质谱鉴定分析,29个显著差异蛋白点中有25个被成功鉴定,鉴定成功的蛋白中除未知蛋白（蛋白点55）和30s核糖体蛋白（蛋白点1089）外,其余蛋白表达量均在施氮条件下上调。通过搜索NCBInr数据库,差异表达的蛋白主要分为8类,包括13个能量相关蛋白,2个防御相关蛋白,2个蛋白合成相关蛋白,2个蛋白目的和储存相关蛋白,1个细胞生长相关蛋白,1个次级代谢相关蛋白,1个转运相关蛋白和3个未知蛋白。【结论】施氮对灌浆期玉米叶片光合能力、碳代谢能力、防御能力、蛋白合成能力、蛋白目的和储存能力、以及次级代谢能力等均有显著提升作用。     

干旱胁迫下玉米开花期雄穗差异表达蛋白质的鉴定与筛选

【目的】 研究玉米开花期不同耐旱性玉米自交系的蛋白质表达差异,分析玉米响应干旱胁迫的主要代谢途径并发掘有价值的耐旱基因,对响应干旱胁迫的差异表达蛋白质组进行筛选和鉴定分析。【方法】 以强耐旱系PHBA6和弱耐旱系吉63为材料,设计干旱胁迫和正常灌溉处理。在玉米开花期进行干旱胁迫处理,取雄穗小花提取蛋白经双向凝胶电泳分离、凝胶图像扫描和质谱分析。【结果】 质谱分析共筛选出542个高清晰、重复性强的蛋白质点。其中,差异表达丰度达2.0倍以上的蛋白质点共有59个,强耐旱系PHBA6中有26个,弱耐旱系吉63中有37个,在强耐旱系PHBA6与弱耐系吉63中都表达且差异显著的蛋白质点有4个。【结论】 干旱胁迫蛋白参与代谢物和能量前体合成、核苷酸代谢、氧化还原辅酶代谢过程、蛋白翻译调控、细胞蛋白质及氨基酸代谢过程的调控、含硫化合物的合成与代谢过程、半胱氨酸的生物合成及代谢过程和光合作用等。细胞组分分类显示二者中的差异蛋白都与叶绿体及其结构相关,而且差异蛋白的细胞组分分类一致,但在生物学代谢过程及分子功能分类上相差较大,这些显著的差异表达的蛋白可能是形成不同品系间耐旱性强弱的主要原因。     

抗条锈病小麦品系Taichuang29*6/Yr5接种条锈菌CY32后的蛋白质组学分析

 【目的】了解抗条锈小麦受条锈菌侵染后的蛋白表达变化情况,采用比较蛋白质组学技术鉴定接种条锈菌小种CY32后的抗条锈小麦品系 Taichuang29*6/Yr5和同时期未接种对照之间的差异蛋白。【方法】提取接种48 h和同期未接种小麦的叶片蛋白,进行双向电泳分离和分析,选取差异显著的蛋白点进行MALDI-TOF质谱分析及数据库搜索鉴定。【结果】发现13个体积百分比变化大于1.5倍,符合t检验（P＜0.05）的显著差异蛋白点,通过MALDI-TOF MS获得了这些差异蛋白点的肽指纹图谱,经数据库搜索,共鉴定出11个蛋白,包括Pathogenesis-related homeodomain protein,beta-glucosidase,glutathione transferase等。【结论】经蛋白质功能分析,推测小麦叶片中这些差异蛋白可能与条锈菌小种CY32的侵染有关。     

小麦抗白粉病基因Pm21抗病差异的蛋白质组学研究

 【目的】对小麦白粉菌侵染后的叶片进行差异蛋白质组学研究,以期发现抗白粉病基因Pm21转入后,对抗病机制起重要作用的蛋白。【方法】以对小麦白粉病敏感（百农3217）和对小麦白粉病免疫（W2132-6,携带抗病基因Pm21）的2个小麦近等基因系为材料,分别提取2个材料拔节期接种48 h后的叶片蛋白,应用双向电泳联合质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析Pm21基因转入后差异蛋白表达。【结果】双向电泳后,CBB染色,用ImageMasterTM 2D Platinum软件分析检测出12个差异蛋白点,经过质谱（MALDI-TOF-MS）分析和数据库检索,鉴定出9个蛋白质,其中7个分别与能量代谢、基因调控、防卫和稳定蛋白质相关,参与了增强能量代谢、基因调控、抗氧化、细胞壁加厚和木质化等抗病生理反应。【结论】抗白粉病基因Pm21转入后,材料对白粉菌侵染响应发生变化,脯氨酸富集蛋白等胁迫反应蛋白得到增量表达,这些蛋白可能与小麦抗白粉病有一定相关性。     

螺虫乙酯抑制西花蓟马卵孵化的蛋白质组学分析

【目的】前期研究发现,螺虫乙酯处理西花蓟马（Frankliniella occidentalis）0 h卵24 h后,造成卵壳破裂从而抑制卵孵化出若虫。本研究旨在探究螺虫乙酯处理西花蓟马0 h卵24 h后引起卵形态结构发生变化的原因,寻找螺虫乙酯抑制西花蓟马0 h卵孵化的关键蛋白,揭示螺虫乙酯抑制西花蓟马卵孵化的分子机制。【方法】以西花蓟马0 h卵为研究对象,使用浓度为14.42 mg·L^-1的螺虫乙酯处理24 h后,采用无标记定量（Label-free）蛋白质组学技术分析螺虫乙酯处理组与对照组之间的差异表达蛋白。利用Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG通路分析对筛选出的差异表达蛋白进行功能注释和通路分析等生物信息学分析,并通过平行反应监测（PRM）技术验证差异蛋白的表达量。【结果】螺虫乙酯处理后共有204个蛋白差异表达,其中124个蛋白表达量上调,80个蛋白表达量下调。生物信息学分析表明,上调的差异表达蛋白主要参与物质合成和代谢通路,下调的差异表达蛋白主要参与对外界刺激的防御反应通路。此外,利用PRM技术对差异表达蛋白进行鉴定,结果表明螺虫乙酯处理西花蓟马0 h卵24 h后,三磷酸鸟苷环水解酶1-1、三磷酸鸟苷环水解酶1-2、类谷胱甘肽硫-转移酶、脂酰辅酶A还原酶蛋白表达量显著上调,西花蓟马卵的类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2、类铜/锌-超氧化物歧化酶、O-乙酰基转移酶蛋白表达量显著下调,且类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2表达量下调最为明显。PRM技术验证结果与蛋白质组学的结果一致。【结论】上述蛋白可能在西花蓟马卵孵化过程中发挥多种功能,其中类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2与昆虫表皮分化等生命活动相关,推测螺虫乙酯抑制了类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2的表达,从而造成西花蓟马0 h卵出现卵壳破裂的现象,类内表皮结构糖蛋白SgAbd-2可能在西花蓟马0 h卵孵化的过程中发挥重要作用。     

‘春甜橘’及其突变体果皮差异相关蛋白质组分析

【目的】柑橘自然芽变材料是柑橘育种的重要来源。‘明柳甜橘’(Citrus reticuiata Blancocv.Mingliutianju,MP)是从‘春甜橘’(C.reticuiata Blanco cv.Chuntianju,CP)中选育出的自然芽变品种。分析‘春甜橘’与其自然芽变‘明柳甜橘’果皮差异蛋白质,探讨导致两品种形态差异的原因。【方法】以花后12周和23周的‘明柳甜橘’和‘春甜橘’果皮为材料,采用双向电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离获得野生型与突变型差异表达蛋白点,利用MALDI-TOF-MS质谱鉴定技术分析相关差异蛋白质,并进行功能注释和生物信息学分析。【结果】将提取的果皮总蛋白质经双向电泳后,分别采用硝酸银和考马斯亮蓝染色法进行蛋白质凝胶染色,均获得了清晰的2-DE电泳图。2-DE图谱经Image Master 2D软件分析表明,硝酸银染色法能检测到约1 200个蛋白点,考马斯亮蓝染色法能检测到约500个蛋白质点,从中各选取20个变化丰度2倍以上且重复性好的蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定和数据库检索分析,共有33个蛋白质有功能注释,其中17个蛋白质在‘明柳甜橘’果皮中表达上调,16个表达下调。按照33个差异蛋白质的功能,可将其分为11类,它们分别参与糖类/能量代谢、胁迫/防御反应、核酸代谢、氨基酸代谢、转录、氮代谢、脂肪酸代谢、蛋白修饰与降解以及未知类。利用KOBAS(KEGG Orthology-Based Annotation System)在线功能分析平台对33个差异表达蛋白质进行信号通路分析,其中18个差异蛋白质有KO注释,共涉及31条信号通路,按照P值大小排列,类黄酮生物合成过程位居第一,说明该信号通路最有可能参与春甜橘芽变形成过程。【结论】综合分析‘春甜橘’和‘明柳甜橘’基因水平及蛋白质水平的差异,推测可能是由参与类黄酮生物合成过程的差异表达基因尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因和差异表达蛋白咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的差异表达导致了二者的表型差异。     

家蚕中肠组织感染质型多角体病毒的应答基因分析

 【目的】筛选家蚕（Bombyx mori）中肠感染质型多角体病毒的应答基因，为阐明家蚕感染质型多角体病的分子机制奠定基础。【方法】 应用含有约23 000个家蚕基因组寡核苷酸芯片比较分析感染家蚕质型多角体病毒24、48及72 h的中肠试验组与中肠对照组的差异表达基因；结合生物信息学工具对差异表达基因的功能注释、分类及涉及的信号通路等进行分析；应用实时荧光定量PCR验证17个基因的差异表达。【结果】 在感染24、48及72 h后，分别得到了9、51及258个差异表达基因。KEGG通路分析表明，在感染48及72 h后，大多数涉及到代谢通路的基因的表达水平下调，所有涉及到核糖体通路和蛋白酶体通路的基因的表达水平上调。一些免疫相关基因如丝氨酸蛋白酶抑制剂、脂酶、热激蛋白、细胞色素P450、核糖体P0蛋白等基因的表达水平上调。【结论】经荧光定量PCR验证的差异表达基因可能与家蚕感染质型多角体病毒的应答机制相关，研究结果为从分子水平上阐明家蚕感染质型多角体病毒的致病机理提供了新的研究方向。