枣疯病植原体新疆分离物16S rDNA基因克隆与序列分析

利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对新疆阿克苏地区和喀什地区的疑似枣疯病植株总DNA进行常规PCR和巢式PCR检测,分别扩增出1.5kb和1.2kb的特异性片段。对片段进行克隆、序列测定分析及系统发育树构建,结果表明,新疆枣疯病阿克苏分离物和喀什分离物的16SrDNA基因序列同源性极高,达到100%,与16SrⅤ组植原体的同源性达到98.4%以上,并且与16SrⅤ-B亚组中的枣疯病山东莱芜株系、山东龙口株系同源性最高,达到99.5%,因此归属于榆树黄化组16SrⅤ-B亚组。首次报道新疆枣疯病植原体16SrDNA的序列,确定新疆枣疯病植原体的分类地位,为枣疯病的早期诊断和检测提供依据。     

赞皇大枣枣疯病植原体分子分类

 【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害，本试验旨在明确惟一已知的天然三倍体品种--赞皇大枣枣疯病植原体的分类地位，为赞皇大枣枣疯病植原体分类研究提供参考。【方法】利用植原体16S rDNA通用引物对赞皇大枣枣疯病病株的DNA进行PCR扩增和克隆测序，通过BLAST比对进行序列分析，利用临位相连法构建16S rDNA系统演化树，并应用DNAstar软件进行虚拟RFLP分析。【结果】获得的赞皇大枣枣疯病植原体16S rDNA序列长度为1 850 bp（GenBank登录号GU184180），包括1 529 bp的16S rDNA基因全序列、264 bp的邻近间隔区序列及57 bp的23S rDNA部分基因序列。同源分析表明，赞皇大枣枣疯病病原16S rDNA序列与其它植原体的相似性在87%—98%，其中与榆树黄化 Elm yellows（EY）(GenBank登录号l33763)最高相似性为98%；与大多数二倍体枣品种的植原体序列相似率达99%以上；其虚拟RFLP图谱与4个16SrⅤ亚组的代表序列图谱差异显著,赞皇大枣枣疯病植原体延伸因子tuf基因的序列(GenBank登录号JN001985) 比对结果表明，与其它亚组序列同源性为52.3%—76.7%。【结论】三倍体赞皇大枣枣疯病病原属于榆树黄化组(16Sr V)，并与其中的B亚组亲缘关系最近；与二倍体品种的病原分类地位一致，说明枣疯病植原体在系统进化上比较保守。     

大连枣树丛植病病原鉴定

针对辽宁大连地区首次发现的枣树丛枝病病原进行了鉴定,利用植原体16S rDNA通用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2对枣疯病(jujube witches’- broom phytoplasma,JWB - DL)植株总DNA进行巢式PCR扩增,并且通过软件pDRAW32进行RFLP电子酶切,根据分析结果构建系统发育树.结果表明,该病原序列与榆树黄花组( 16SrV)中的各亚组植原体同源率为99％以上,其中与16S rV -B亚组樱桃致死黄化(Cherry lethal yellow,CLY)同源性高达100％,而与其他组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于96％,由此推断引起大连枣树丛枝病的为16SrV-B亚组的枣疯病植原体.     

枣疯植原体rp基因和secY基因序列分析

【目的】基于核糖体蛋白基因(rp)和运输蛋白基因(secY),明确了陕西、山西及山东3省枣疯植原体的亚组分类地位。【方法】采集陕西、山西及山东3省枣产区的枣疯病样品,提取样品总DNA;设计引物对rpF1、rpF2、rpR1和secF1、secF2,对枣疯植原体的rp基因和secY基因进行PCR扩增及核苷酸序列测定与系统发育分析。【结果】获得枣疯植原体的rp基因和secY基因,大小分别为1 196和1 421bp。序列比对结果表明,陕西、山西及山东3个省枣疯植原体的rp基因和secY基因序列均一致;系统发育分析表明,这3省的枣疯植原体与樱桃致死黄化植原体(CLY5)和桃树黄化植原体印度株系(PY-In)的亲缘关系最近。【结论】以rp和secY基因作为植原体16SrRNA基因分类系统的辅助分子证据,将陕西、山西、山东的枣疯植原体归属到16SrⅤ-B亚组,明确三省内枣疯植原体的亲缘关系。     

海南苦楝丛枝病植原体核糖体蛋白基因片段序列分析

【目的】利用分子生物学方法分析采自海南儋州的苦楝丛枝病植原体核糖体蛋白(rp)基因,从亚组水平上确定苦楝丛枝病植原体的分类地位。【方法】利用植原体核糖体蛋白基因通用引物对rpF1/rpR1,应用PCR技术对苦楝丛枝病植原体的核糖体蛋白基因进行扩增,对其核苷酸序列进行测定并分析。【结果】通过PCR扩增得到约1.2 kb的特异片段,测序结果表明该片段长1 240 bp,包括rps19基因的3′区域,rpl22和rps3基因的全部区域。进一步分析发现,该片段与苦楝丛枝病贵州株系(Chinaberry witches’-broom,CWB-GZh)的亲缘关系最近,核苷酸同源性达99.9%。基于核糖体蛋白基因核苷酸序列,构建了海南苦楝丛枝病植原体与其他18个已知分类地位植原体的系统分类树状图,结果表明,引起海南苦楝丛枝病的植原体与16SrⅠ-B亚组植原体越南苦楝黄化、苦楝丛枝贵州株系和苦楝丛枝云南株系在同一条进化枝上。【结论】报道了海南苦楝丛枝病植原体的核糖体蛋白基因序列,海南苦楝丛枝病植原体属于16SrⅠ-B。     

新疆柳树花变叶植原体分子鉴定

为研究新疆7个地区柳树花变叶病为何种病原物所造成，本研究以分子生物学技术对其进行鉴定。通过CTAB法提取柳树总DNA，对其16S rRNA基因和tuf基因进行PCR扩增，将测序得到的基因片段通过Blast比对、同源性比较，构建系统进化树和16S rRNA虚拟RFLP分析。结果显示，PCR扩增分别获得16S rRNA（1 238 bp）和tuf（824 bp）的片段，证明该病害与植原体有关，将其命名为柳树花变叶植原体（WPP）；16S rRNA序列分析表明，WPP与中国桃黄化植原体（‘Prunus persica’ yellows phytoplasma）、枣疯病（‘Ziziphus jujuba’ witches’-broom phytoplasma）、杏褪绿卷叶植原体（Apricot leaf roll phytoplasma）同源性均为99.68%；16S rRNA虚拟RFLP分析结果表明，WPP与枣疯病株系（GenBank登录号：AB052876）有 99.8%的相似性，虚拟RFLP模式与16SrV-B亚组的参考模式相同，相似系数为1.00，进一步证明WPP为16SrV-B亚组成员。WPP tuf基因与榆树黄化组(EY)同源性达99%以上，系统进化树显示，柳树花变叶植原体与榆树黄化组（16SrV）植原体聚为一枝。柳树花变叶植原体属于16SrV-B、tuf-B亚组。     

枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和tuf基因的序列同源性分析

 【目的】枣疯病是枣树上由植原体引起的一种毁灭性病害，遍布于中国华北、西北、华东、华南等25个省(市)的枣区，造成了巨大的经济损失。【方法】经PCR扩增，分别对中国陕西的彬县、阎良、武功、佳县、杨凌，河北沧州和山东德州7个枣区的枣疯病样品和杨凌4个酸枣丛枝病样品植原体16S rDNA基因保守序列和延伸因子tuf基因进行克隆和测序。【结果】获得枣疯病和酸枣丛枝病植原体的16S rDNA基因片段均为1 239 bp，tuf基因均为851 bp。通过序列同源性比较，结果表明中国陕西、河北、山东的枣疯病的病原一致，归属于植原体16S rⅤ-B组。由于枣疯病和酸枣丛枝病的植原体16S rDNA有5个碱基的差异，tuf基因的同源性为99.6%，推测为同一个种的不同寄主生物学型。【结论】首次报道了中国枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和延伸因子tuf基因的序列，确定了枣疯病和酸枣丛枝病植原体的分类地位，为研究枣疯病植原体的致病分子机理、遗传本质提供理论依据。     

苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定

【目的】对苦豆子丛枝病植原体做出分子检测与鉴定。【方法】通过PCR扩增技术,分别利用植原体16S rRNA基因,16S-23S rRNA间区及tuf基因序列的通用引物对表现丛枝病症状的苦豆子总DNA进行扩增,得到约1.2、0.3和0.8 kb特异片段。将所得片段分别进行克隆、测序及序列同源性分析。【结果】苦豆子丛枝病植原体(SAWB)上述3序列与榆树黄化组B亚组(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB)相应序列的同源性最高。【结论】苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员。     

北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段。对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1 248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%。序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组。     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

枣疯病病树中内源激素的变化研究

【目的】揭示枣疯植原体对枣树内源激素的影响，弄清枣疯病病树中内源激素的变化趋势。【方法】应用HPLC法分别对健株、病株和盐酸土霉素治疗后转健植株中的细胞分裂素（玉米素，Zeatin）、生长素（吲哚乙酸，IAA）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）的含量进亚周年检测。【结果】在根部，健株、治疗株和病株中IAA、GA3和ABA的含量没有明显区别，但在7、8月份病株根部中Zeatin的含量要明显高于健株；在叶部，健株、治疗株和病株中的IAA、GA3和ABA的含量也没有明显区别，但在生长后期病株叶片中Zeatin含量显著高于健株。不同患病程度叶片中激素的比较结果表明，患病程度越重，Zeatin/IAA（C/A）比值越高。【结论】植原体侵染枣树植株后致使其内源激素失衡，主要是细胞分裂素含量的增加，最终导致了枣疯病症状表现。     

枣疯病研究的进展

本文综述了近年来对枣疯病的发生、症状发展过程、症状形成的病生理学基础、传病介体昆虫、病原菌在枣树体内的运行规律以及枣疯病MLO单克隆抗体的检测技术等的研究新进展。     

枣树叶片蛋白质提取及SDS-PAGE单向电泳条件优化

[目的]对枣树叶片蛋白质提取方法及其SDS-PAGE单向电泳条件进行优化。[方法]对枣树5种蛋白质提取方法和影响SDS-PAGE单向电泳的因素进行比较研究。[结果]改良丙酮沉降法提取出的蛋白质杂质较少,条带数量多且清晰,同时通过研究确定了一套适用于枣树蛋白检测的SDS-PAGE凝胶制备及电泳方法。[结论]该研究为进一步从分子生物学的角度研究枣树与枣疯病植原体的互作机制提供了技术的基础。     

枣疯病植原体越冬后向枣树不同类型新生组织转移特性研究

为明确枣疯病植原体越冬后向新生组织的转移扩散特点,从而指导枣疯病预防和控制,本研究采用PCR和DAPI荧光显微技术,比较枣疯病植原体向枣树不同类型新生组织的转移情况。结果表明:室内水培的疯枣枝在萌芽30d后,新生叶片可以检测到植原体;自然栽培枣树的枣股新生叶片生长发育至24d出现植原体;枣树根蘖在萌芽后12d即可检测到植原体。嫁接试验表明,嫁接于染病冬枣砧木上的易感品种接穗‘唐星’,‘阜星’,其萌发的新生幼叶在第34天即可检测到植原体,而抗病品种‘星光’接穗在第119天才检测到植原体。由此可见,枣疯病植原体在地上和地下部分均可以越冬,越冬的植原体向枣树不同类型和不同品种新生组织中的转移扩散速度存在差异,由快到慢为根蘖>自然生枝条>离体水培枝条>嫁接接穗。     

竹丛枝病病原研究进展

 竹丛枝病是竹类植物产生丛枝状病害的总称，是竹林退化最具破坏性的病害之一。大量研究表明：竹针孢座囊菌Aciculosporium take，异香柱菌属Heteroepichloё，竹暗球腔菌Phaeosphaeria bambusae以及植原体（phytoplasma）等均能引起竹丛枝病。长期以来这些病原物所处分类地位的变化较大且它们的致病机制尚不清楚，这对竹丛枝病的防治造成了极大的困难。对上述病原物所处分类地位的演变过程及其致病机制的研究进行了综述，并对竹丛枝病今后的研究方向进行了展望。参26     

橡胶树丛枝病的组织结构观察及分子发生机理

运用组织结构解剖学方法研究巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)丛枝病，对比丛枝病橡胶树与健康橡胶树的组织结构差异。采用新一代高通量测序技术Illμmina HiSeq 2000对丛枝病橡胶树和健康橡胶树进行转录组测序。石蜡切片观察结果表明，以健康橡胶枝茎做为对照，丛枝病橡胶枝茎形成层明显变薄，周皮部份占树皮比例明显变小，次生木质部导管变细，初生韧皮纤维外侧没有石细胞存在；丛枝病橡胶叶片栅栏组织较健康叶片变薄，海绵组织较健康叶片变厚。转录组测序结果表明，以健康橡胶树为对照，丛枝病橡胶树的黄酮类化合物和油菜素类固醇生物合成两条代谢途径出现明显紊乱。植原体感染橡胶所引起的代谢紊乱可能是导致橡胶树解剖学结构差异的原因。     

枣疯病研究进展

主要从枣疯病症状、检测方法、致病机理、对枣树生理代谢的影响、传播途径和方式、防治技术等几个方面的研究进展作简要概述,以供参考。     

枣疯病病原体的超微形态及其分布

通过对冬疯病显病枝条上嫩枝、花轴、叶片、枝条韧皮都、叶柄及花瓣等不同部位组织的超微形态观察研究,确定未疯病的病原体为近圆形、椭圆形以及多种不定形的类苗质体（MID）。此外在枝条的韧皮部及叶柄的薄壁细胞的细胞质中,还观察到一些类病毒粒子和均一至晶格状排列的颗粒。本文为进一步研究枣疯病的致病机理提供一些重要的线索。