加工番茄骨干自交系对叶霉病的抗性鉴定及抗病基因(Cf-9)检测

以218份加工番茄骨干自交系为试验材料,采用叶面喷雾的方法对其中30份自交系进行菌悬液室内人工接种,评价不同加工番茄自交系对番茄叶霉病的抗性表现;同时利用基因功能标记对所有参试材料进行分子检测,明确这些材料中是否含有抗番茄叶霉病基因(Cf-9)。室内人工接种鉴定结果表明,在30份加工番茄骨干自交系中,共筛选出抗病材料6份,中抗材料16份,感病材料7份,高感材料1份,其占比例分别为20.0%、53.3%、23.3%和3.4%。特异引物PCR检测结果表明,在218份加工番茄骨干自交系中,含抗叶霉病基因(Cf-9)的材料有74份,占总数的33.9%;不含抗叶霉病基因(Cf-9)的材料有144份,占总数的66.1%。总体来看,在新疆加工番茄骨干自交系中,以中抗叶霉病材料居多,选用抗病自交系(亲本)配制杂交组合,并利用基因功能标记在育种早代筛选抗病基因型,有助于提高选择效率,加速新疆加工番茄抗病育种进程。     

日光温室秋冬番茄多抗优良品种的筛选

本试验主要对14个番茄材料进行了Ty-1,Ty-2,Ty-3,Mi-1和Cf-9共5个抗性基因的检测,并在自然条件下观察番茄植株对黄化曲叶病毒病、叶霉病、根结线虫病的抗性.生物学检测结果表明, 14个材料均含有黄化曲叶病毒病抗性基因、根结线虫抗性基因Mi-1和番茄叶霉病抗性基因Cf-9.其中, 2个番茄材料含有5个抗性基因, 8个材料含有4个抗性基因, 4个材料含有3个抗性基因.田间抗病性调查并未发现显著的感病情况.此外,还对其生长习性等13个农艺性状进行了调查和统计.综合抗病能力以及田间表现, 14,21,金棚8B等3个品种抗病能力强,生长势好,产量较高,比较适宜日光温室秋冬茬番茄的种植.     

番茄叶霉病抗性基因Cf-5、 Cf-9和Cf-12介导的抗性生理研究

为明确番茄叶霉病抗性基因Cf-5、Cf-9和Cf-12介导的过敏反应中抗性生理间差异,为Cf-0 (CK)、Cf-5、Cf-9、Cf-12番茄材料接种叶霉菌生理小种1.2.3,并比较各抗性材料在活性氧暴发、H2O2积累、水杨酸含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、多分氧化酶活性变化等相关生理生化指标异同.结果表明,Cf-9、Cf-12积累活性氧和HR坏死斑点数稍高于Cf-5,说明Cf-9、Cf-12发生早期防御信号较Cf-5强;细胞保护酶类测定结果表明,含Cf-5、Cf-9、Cf-12基因抗性材料各保护酶变化趋势大致相同,但部分指标间存在显著差异,均与对照(Cf-0)各指标在变化趋势及变化量上差异显著;水杨酸测定结果证实其对产物结构相似Cf基因介导的过敏性坏死反应作用存在差异.综合各抗性材料、抗性生理指标与抗病性鉴定结果,表明含Cf-9基因材料对叶霉菌抗性较Cf-5、Cf-12基因材料强,抗性基因对叶霉病抗性主要通过调控体内细胞保护酶类活性及水杨酸含量提高叶霉菌抗性.     

Cf-19介导的抗番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）免疫应答酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定

番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)是番茄栽培生产中最严重的病害之一,造成严重经济损失。Cf-19基因是目前已知抗性最强、抗性范围最广的叶霉病抗病基因之一,其免疫应答过程具有代表性,为研究Cf-19介导的免疫应答过程中蛋白质互作机制,采用Gateway技术构建Cf-19介导的抗番茄叶霉病免疫应答酵母双杂交cDNA文库。结果表明,酵母cDNA文库滴度为5.0×10~7CFU·mL~(-1),重组率为100%,cDNA文库插入片段长度500～2 000 bp,插入片段平均长度1 000 bp以上。由此可知,Cf-19介导的抗番茄叶霉病(C. fulvum)免疫应答酵母双杂交cDNA文库,可用于筛选互作蛋白。     

番茄抗叶霉病基因Cf-11的AFLP分子标记

本试验分析了组合HN16(感病品种)×HN42(抗病品种)的杂交后代F1、F2对番茄叶霉病菌1.2.3.4生理小种的抗病反应。经人工接种鉴定表明,两个亲本间抗、感差异明显,父本HN42表现抗病,母本HN16表现感病;F2群体抗病与感病株数的分离比为3.17:1.00,符合3:1的分离比例。遗传分析结果表明,父本HN42对番茄叶霉病菌1.2.3.4生理小种的抗性是由单基因控制的显性性状。筛选到4个与抗番茄叶霉病基因Cf-11连锁的AFLP分子标记,分别为E54M37-G、E62M61-A、E85M79-D和E62M59-G,与Cf-11的遗传距离分别为10.1、12.3、14.5、18.8cM。     

分子标记辅助聚合多抗番茄砧木材料的筛选

以20份高世代稳定番茄砧木自交系为材料,对番茄砧木材料进行田间主要病害抗病性评价,以期筛选出抗性材料,为抗病育种提供材料。通过田间抗性鉴定和对5种病害抗性基因(I-2、RRS-342、Tm-2a、Mi-1、Cf-9)进行检测,进而鉴定筛选出聚合多抗番茄砧木。结果表明,Y-7-1、ZM22-1-10的青枯病、根线虫、烟草花叶病毒、叶霉病病情指数均达到抗病以上水平,且均检测到所有的抗病基因标记,是聚合多抗番茄砧木材料。     

利用PCR技术同时检测番茄抗根结线虫基因(Mi-1)和抗叶霉病基因(Cf-9)

   利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗根结线虫的Mi-1基因和抗番茄叶霉病的Cf-9基因紧密连锁的CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合与Cf-9基因紧密连锁的CAPSl标记在抗病试材中可扩增出2775 bp的特异片段,且存在Taq I酶切位点,酶切后产生1177 bp、446 bp、370 bp和160 bp的不同特异片段;与Mi-1基因紧密连锁的CAPS2为共显性标记,抗性材料中产生915 bp的特异片段,Taq I酶切后产生719bp和196 bp的特异片段该体系可用于在同一PCR反应体系中对Mi-1和Cf-9 2个抗病基因进行同时筛选鉴定该体系的建立不仅省时、省工,节省费用,而且可用于苗期早期辅助选育,加快番茄育种进程     

分子标记辅助聚合多抗番茄砧木材料的筛选

以20份高世代稳定番茄砧木自交系为材料,对番茄砧木材料进行田间主要病害抗病性评价,以期筛选出抗性材料,为抗病育种提供材料.通过田间抗性鉴定和对5种病害抗性基因(I-2、RRS-342、Tm-2a、Mi-1、Cf-9)进行检测,进而鉴定筛选出聚合多抗番茄砧木.结果表明,Y-7-1、ZM22-1-10的青枯病、根线虫、烟草花叶病毒、叶霉病病情指数均达到抗病以上水平,且均检测到所有的抗病基因标记,是聚合多抗番茄砧木材料.     

番茄抗叶霉病基因Cf-10和Cf-16的遗传分析及SSR标记

以Cf-10和Cf-16基因对东北三省分离鉴定的8个番茄叶霉病病原菌生理小种的抗性进行了评价,表明Cf-10和Cf-16基因对分化出的生理小种具有良好的抗性。分别对07881×08HN30(含Cf-10)和07880×08HN34(含Cf-16)构建的F1、F2代分离群体进行了遗传分析,并对F2群体进行了SSR标记。遗传分析表明,08HN30和08HN34的抗性均由一对显性单基因控制,从341对SSR引物中筛选出2个与Cf-10基因连锁的标记LEtaa001和LEaat003,遗传距离分别为9.7和22.9 cM;1个与Cf-16基因连锁的标记Tom144-145,遗传距离为10.4 cM。上述研究结果为抗源基因在番茄抗叶霉病育种中的应用及进一步精细定位Cf-10和Cf-16基因奠定了基础。     

辣椒LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

【目的】克隆和分析抗、感疫病辣椒材料的抗病基因同源序列,为辣椒抗疫病相关基因的克隆奠定基础。【方法】根据番茄抗叶霉病基因Cf2和Cf9 C端的LRR类保守结构域设计简并引物,对6个不同抗、感疫病的辣椒种质材料基因组DNA进行抗病基因同源序列的PCR扩增。【结果】得到27个抗病基因同源序列(RGAs),其在GenBank中的登录号为EF064260~EF064286。其中,21个RGAs与番茄抗叶霉病基因Cf2和Cf9有较高的相似性。感病材料的辣椒基因组中也存在抗疫病相关RGAs。【结论】上述21个RGAs可能与辣椒抗疫病作用有关,可为辣椒抗疫病相关基因的克隆提供依据。     

Development of Molecular Marker Linked to Cf-10 Gene Using SSR and AFLP Method in Tomato

The leaf mould resistance gene Cf-10 on tomato confered resistant or immune to all prevalent physiological races of Cladosporium fulvum presented in three northeastern provinces of China in inoculation...     

番茄抗黄化曲叶病毒病基因的AFLP分子标记

用番茄抗黄化曲叶病毒病品系‘T0727’与高感黄化曲叶病毒病品系‘T9179’配制杂交组合,接种鉴定其F₁代及F₂代分离群体的黄化曲叶病毒病发生情况。用64对EcoRⅠ/MseⅠ引物组合对‘T0727’、‘T9179’两个亲本及其F₁代和F₂代抗病和感病基因池进行AFLP分析,共扩增出4 023条可分辨的条带,其中3条为稳定的差异。用‘T0727’和 ‘T9179’杂交产生的F2代分离群体对3个特异条带与目的基因的遗传连锁性进行分析,发现特异条带E-ACC/M-CAG与抗黄化曲叶病毒病基因紧密连锁,二者之间的遗传距离为9.5 cM。将E-ACC/M-CAG片段回收、克隆和测序,成功地将其转化为SCAR标记,暂定名为Afty-196,可以用于对番茄黄化曲叶病毒病基因的标记辅助选择。     

番茄抗番茄花叶病毒和斑点萎凋病毒病基因PCR标记的同时鉴定

 利用同一PCR反应体系,对分别与番茄的抗番茄花叶病毒病的Tm22基因和抗斑点萎凋病毒病的Sw-5基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合,其中与Tm22基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感试材均产生800bp的特异片段,杂合抗病基因型和感病基因型有HindIII酶切位点,酶切结果为:纯合抗病RR:950bp;杂合抗病Rr:950bp+500bp+300bp+150bp;感病的rr:500bp+300bp+150bp,纯合抗病基因型无HindIII酶切位     

西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因连锁标记开发

【目的】开发与栽培西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因Fon-1紧密连锁的分子标记,为开展西瓜抗枯萎病分子辅助育种提供技术支撑。【方法】以栽培西瓜抗枯萎病品种Calhoun Gray为父本,感病品种Black Diamond为母本杂交获得的F2分离群体为供试材料,采用BSA法对Fon-1基因进行区间定位。依据11份栽培西瓜重测序信息,获取位于定位区间内的候选SNP位点。针对候选SNP位点设计CAPS/dCAPS标记,通过F2代分离群体和种质资源验证上述标记与Fon-1基因的连锁关系。【结果】通过BSA法,将Fon-1基因定位于1号染色体15 cM区间内。利用候选SNP位点信息,开发3个CAPS/dCAPS标记7716_fon、7419_fon和4451_fon,F2代分离群体以及164份西瓜育种材料验证显示,上述3个标记与Fon-1基因的连锁距离分别为0.8、1.0和2.8 cM。【结论】利用栽培品种Calhoun Gray的抗性遗传机制,开发的3个CAPS/dCAPS标记可以有效区分栽培西瓜对枯萎病菌生理小种1的抗病、感病性,为栽培西瓜品种枯萎病菌生理小种1抗性基因快速应用于栽培品种枯萎病抗性改良建立有效的技术手段。     

聚合抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）及抗稻瘟病基因Pi9水稻株系筛选

【目的】筛选聚合抗褐飞虱和抗稻瘟病基因水稻材料,为培育新型抗褐飞虱兼抗稻瘟病的水稻新种质提供参考。【方法】利用常规育种、分子标记辅助育种和抗病虫鉴定相结合的手段,将抗稻褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）以及广谱高抗稻瘟病基因Pi9聚合到优良保持系博ⅢB的遗传背景中。【结果】bph20（t）的分子标记RM540和BYL7、bph21（t）的分子标记RM5348和RM222未在稻褐飞虱抗、感亲本间扩增出特异条带,无明显的多态性,不能用于该育种群体抗褐飞虱基因bph20（t）和bph21（t）的检测。Pi9的显性分子标记pB8以及共显性分子标记PB9-1在稻瘟病抗、感亲本之间可扩增获得特异条带,具有多态性,可用于Pi9基因的检测。经抗虫鉴定并利用标记PB9-1对BC6F2群体的22株材料进行PCR扩增,含有Pi9基因杂合体的有10株,纯合体有6株,不含Pi9基因的有7株。用源自广西南宁田间感褐飞虱和稻瘟病菌株进行多次抗病虫鉴定,筛选获得一批抗褐飞虱材料,其中抗性与抗虫亲本BPH54相当的材料有6份,在这6份材料中含有Pi9基因且抗稻瘟病的材料有5份,对稻褐飞虱的抗性与供体亲本BPH54水平相当。【结论】通过常规育种、分子检测和抗虫鉴定相结合的办法,筛选获得5份聚合褐飞虱抗性基因（bph20和bph21）和抗稻瘟病基因Pi9的抗或高抗水稻中间材料,为选育新的双抗保持系和不育系提供种质材料。     

番茄抗性基因Ty-1的PCR快速检测

利用国内外已发表的10对标记引物对抗番茄黄化曲叶病毒病纯合系"JZ-108"(Ty-1/Ty-1)、感病纯合系"1712"(ty-1/ty-1)及杂交F1代的Ty-1抗性基因进行PCR扩增筛选,筛选出一对特异性引物SSR47,在抗病纯合材料中产生750 bp的扩增片段,感病材料中产生640 bp的片段,抗病杂合材料中同时产生750 bp和640 bp的扩增片段,标记结果与田间鉴定完全一致,证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对"JZ-108×1712"F2代的48个单株进行检测,有8株为抗病纯合基因型,19株为感病纯合基因型,21株为抗病杂合基因型,其中抗病纯合株与抗病杂合株田间表现均为抗病。经反复验证,结果准确可靠,该标记可用于对番茄抗病基因Ty-1的快速筛选鉴定。     

团头鲂MHCⅡ α基因的SNP位点开发、鉴定及与抗病性状关联分析

用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染团头鲂(Megalobrama amblycephala)区分抗病和易感组,通过PCR扩增及测序在MHCⅡα基因上筛选单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNP),利用高分辨率熔解曲线法和限制性内切酶酶切法对SNP进行分型,分析其多态性及与抗病性状之间的关系。在MHCⅡa基因上共筛选出35个候选SNP位点,占MHCⅡa基因总碱基的1.45%,包含30个转换位点、5个颠换位点。其中外显子部分有16个,内含子部分7个,5′非编码区有1个,3′非编码区有11个。有13个SNP位点位于编码区,占总氨基酸位点的5.56%,位于839bp的T/A颠换和1 663bp的A/G转换是无义突变,其余11个SNP位点为有义突变。α1结构域的SNP位点分别占总碱基和总氨基酸位点的4.88%和10.98%,明显高于α2结构域的1.08%和3.22%。MHCⅡα基因的21个抗原结合位点(peptide binding region,PBR)中,有4个位点变异,变异率为19.05%;而non-PBR的变异率仅为8.20%(5/61)。用SPSS软件对分型成功的5个SNP位点在易感和抗病组各100尾中的基因型频率和等位基因频率进行了统计。通过卡方检验分析发现位于1 395bp(T/A)位点的基因型频率和等位基因频率在易感和抗病组中差异极显著,位于221bp(G/T)和1 859bp(G/T)位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗病组中差异显著。本研究结果表明团头鲂MHCⅡα基因的多态性和抗细菌性败血症性状显著关联。     

基于HRM获得与桃Tssd紧密连锁的SNP标记

【目的】植物中,SNP标记具有分布广泛、分辨率高、共显性和多态性高等特点,是遗传研究的常用分子标记。桃全基因组测序完成,获得了大量SNP位点。利用现有的SNP数据进行简单、快速的SNP基因分型是基因定位、品种鉴定和图谱构建等后续研究的基础。文章拟建立采用高分辨率熔解曲线进行不同类型SNP的基因分型方法,以获得与桃温度敏感半矮生型基因紧密连锁的分子标记。【方法】以普通生长型(ST)单株97-32-46为母本,温度敏感半矮生型单株03-94-2(Tssd)为父本进行人工杂交,利用其分离群体96个后代单株为研究材料。在定位目标基因的区间内开发连锁和不同类型的SNP标记的基础上,采用高分辨率熔解曲线进行SNP的基因分型并获得与目标性状紧密连锁的SNP标记。【结果】明确了DNA模板和Mg~(2+)是影响基因分型的关键因子,并确立了反应体系最佳浓度区间。在15μL反应体系中模板DNA的量低于5.0 ng时或Mg~(2+)浓度低于1.6μmol·L~(-1)时则不能完成PCR扩增和基因分型;根据亲本基因型和表型一致的SNP位点设计引物,扩增片段长度在140 bp左右。高分辨率熔解曲线分析可对由单个核苷酸变异引起的4种不同类型的SNP(A/T、A/G、A/C和C/G)进行基因分型,并正确区分了温度敏感半矮生型和普通生长型,与进行Sanger测序鉴定的结果一致。采用96孔板对温度敏感半矮生型和普通生长型各48个分离后代单株进行了PCR扩增和基因分型,确定了遗传距离。分型结果表明高分辨率熔解曲线分析技术可以将96个样杂交后代单株分为温度敏感半矮生型和普通生长型2种,正确地区分了A/A基因型和A/T基因型。在96个样品中仅1个没有成功扩增,在温度敏感半矮生型和普通生长型中各存在1个重组单株。获得与温度敏感半矮生型基因紧密连锁的SNP标记,遗传距离为2.11 cM。【结论】建立了基于高分辨率熔解曲线分析的SNP基因分型。尽管高分辨率熔解曲线分析技术无法区分两种不同纯合类型的SNP变异,但仍不失为区分已知变异SNP的有效方法。在已经获得桃大量SNP的基础上,该体系可用于桃的基因定位、遗传多样性和品种鉴定等研究。     

番茄种质抗黄化曲叶病毒病Ty-1基因的分子标记分析与田间抗病评价

利用SNP分子标记对12份番茄种质的Ty-1基因连锁标记进行检测,同时采用田间鉴定方法,综合评价番茄种质资源的对番茄黄化曲叶病毒病的抗病性。结果表明FQSH1、FQSH4、FQSH5、FQSH10、FQSH11和FQSH25为纯合抗病资源(基因型Ty-1/Ty-1),田间表现为抗番茄黄化曲叶病毒病;FQZJ6和FQSH34为杂合抗病资源(基因型Ty-1/ty-1),田间表现为抗番茄黄化曲叶病毒病。野生2、FQZJ4、FQZJ9和野生3为感病纯合资源(基因型ty-1/ty-1),其中FQZJ4田间表现为抗病,其他为感病。分子标记分析结果与田间鉴定结果基本一致。