大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

转hrpZpsta抗病基因大豆的研究

【目的】将具有广谱抗病性的hrpZpsta基因导入大豆,为培育抗灰斑病的转基因大豆新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为受体,将具有广谱抗性的hrpZpsta基因转入大豆品种"吉林30"中,以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对转基因植株进行PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测分析。【结果】确定的NaCl筛选浓度为200mmol/L。对T1、T2和T3代转基因植株进行PCR检测,得到T1代阳性植株30株,T2代45株,T3代284株,说明外源hrpZpsta基因在转基因后代中能够遗传。Southern杂交结果表明,外源目的基因hrpZpsta已经整合进大豆基因组中,且整合位点不尽相同。RT-PCR结果表明,hrpZpsta基因在受体大豆中获得表达。【结论】获得了hrpZpsta基因遗传表达的T3代转基因大豆株系。     

大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

大豆铁结合蛋白基因在早稻中的表达及铁含量分析

【目的]尝试利用转基因方法提高早稻铁含量。【方法]采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株R～T。代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的ds RNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体p CAMBIA3300中,构建植物表达载体p CAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子Ca MV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂(500 mg·L-1 Basta)喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T2和T3代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用q RT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦(5 mg·L-1)大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T1—T3代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照(非转基因大豆)植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1—2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11—22.22,较对照(病情指数36.81—46.24)显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。q RT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

转Cry1Ia基因抗虫大豆对鳞翅目靶标害虫的抗性分析

以转Cry1Ia基因抗虫大豆株系KE1为试验材料,分析其遗传稳定性及鳞翅目靶标害虫抗性,计算实验室内和田间环境下,甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、黏虫和大豆食心虫叶面积损失率、幼虫平均校正死亡率、平均体重抑制百分率和虫食率.结果表明,KE1株系中目的基因Cry1Ia和标记基因Bar在T3～T5代中连续三代稳定遗传.KE1对靶标害虫斜纹夜蛾(S.litura)、甜菜夜蛾(S.exigua)、粘虫(M.separata)和大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella Matsumura)等鳞翅目表现抗虫,对照植株垦农18表现感虫,说明在垦农18中Cry1Ia基因表达可提高受体垦农18对鳞翅目害虫抗虫水平.     

大豆胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶基因双价RNAi表达载体的改造及转化

【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3个品种中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR分子水平检测和除草剂抗性检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定以及测序结果表明,双价RNAi植物表达载体pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar构建成功。将其转入到大豆中,分别获得吉农18、吉农28、吉农27T1代籽粒47,25和86粒,以及T2代转基因植株50株。RT-PCR结果表明,转基因株系中脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制剂mRNA积累受到明显抑制。【结论】获得了转pCAMBIA1301-KtiRi-LoxRi-bar的T2代转基因大豆。     

大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1的克隆及功能分析

【目的】获得大豆疫霉根腐病抗性相关基因,为培育大豆抗病品种提供理论依据。【方法】在以大豆抗病品种绥农10构建的受疫霉菌诱导后差异表达的cDNA消减文库的基础上,选取文库中一条与其它植物的DR1基因具有较高同源性且上调表达的EST序列。通过RT-PCR方法从绥农10中克隆该基因,并构建到植物表达载体pCAMBIA3301上,以感病品种东农50的子叶节为外植体通过根癌农杆菌介导的方法进行大豆遗传转化。【结果】该基因全长805 bp,开放读码框为471 bp,编码156个氨基酸,在此命名为SDR1。遗传转化获得转基因PCR鉴定阳性植株5株,Real-time PCR检测T1转基因植株较非转基因植株SDR1表达量提高20倍以上的有3株,经Southern杂交分析表明,出现杂交信号的有3株。经离体叶片接种大豆疫霉菌,转基因大豆的抗性较非转基因大豆明显提高。【结论】成功克隆了大豆疫霉根腐病抗性相关基因SDR1,并通过对过量表达的大豆转基因植株的抗病性鉴定初步确定了SDR1的抗病功能。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

防治大豆主要害虫药剂与方法筛选试验

通过田间小区试验,比较几种杀虫剂及两种防治方法对大豆蚜虫及大豆食心虫的防治效果,筛选出防效较好的3种杀虫剂:绝蚜、利镖和甲维盐,为大豆害虫防治提供依据。     

浸泡条件对黄豆芽生长的影响及其大豆异黄酮含量

[目的]确定黄豆芽生长的最佳生产条件.[方法]以黄豆芽的发芽率、生长条件为指标,研究黄豆的浸泡加水量、浸泡温度对黄豆芽生长的影响;同时研究大豆异黄酮随黄豆芽生长的变化规律.[结果]试验得出生产黄豆芽的最佳浸泡条件为:加水量2倍豆重,浸泡温度为25℃;发现大豆异黄酮随黄豆芽生长而逐渐增加.[结论]研究可为黄豆芽的生产和营养价值研究提供参考依据.     

大豆及3种豆制品中大豆异黄酮组分的含量研究

[目的]建立高效液相色谱法测定大豆及3种豆制品中大豆异黄酮组分和含量的方法,研究其大豆异黄酮组分的差异。[方法]将供试样品用80%甲醇溶解提取,净化后用Wonda Sil C_(18)WR(4.6×250 mm,5μm)色谱柱分离,以乙腈和磷酸水溶液(p H 3.0)作为流动相,流速1 m L/min,柱温为40℃,用二极管阵列检测器在波长260 nm检测大豆异黄酮组分,用外标法进行定量。[结果]大豆及3种豆制品中大豆异黄酮的含量,大豆最高,其次是豆芽、豆腐、豆浆。供试样品的大豆异黄酮组分中大豆苷相关系数为0.997 2,黄豆黄苷相关系数为0.999 6,大豆苷元相关系数为0.994 7,黄豆黄素相关系数为0.999 1,染料木素相关系数为0.994 2,平行测定结果之差均低于算术平均值的10%。[结论]高效液相色谱法可用于豆制品中大豆异黄酮组分和含量检测。     

大豆皂苷和异黄酮对小鼠血脂的调节作用

[目的]研究大豆皂苷与异黄酮对小鼠血脂的影响,为从食疗方面调节血脂的研究提供依据.[方法]将72只(7周大小)健康昆明小鼠随机分成6组,分别为基础组、高脂饲料组、高脂饲料+大豆皂苷低剂量组(25 mg/(kg· d))、高脂饲料+大豆皂苷高剂量组(50mg/(kg·d))、高脂饲料+大豆异黄酮低剂量组(50 mg/(kg·d))、高脂饲料+大豆异黄酮高剂量组(100 mg/(kg·d)).连续灌胃4周后,眼球取血,测定血清的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平.[结果]与基础组比较,高脂组小鼠的血清甘油三酯、总胆固醇水平和低密度脂蛋白水平都显著升高(P＜0.05),高密度脂蛋白水平显著下降(P＜0.05).与高脂组比较,大豆异黄酮高、低剂量组的总胆固醇和低密度脂蛋白的水平都显著降低(P＜0.05),高密度脂蛋白的水平都显著上升(P＜0.05).大豆皂苷低剂量组的总胆固醇和甘油三酯水平显著低于高脂组(P＜0.05),高密度脂蛋白的水平显著升高(P＜0.05),高剂量组的大豆皂苷的甘油三酯水平显著下降.[结论]大豆皂苷和大豆异黄酮对调节小鼠血脂都有一定的效果,对高脂血症都有一定的预防作用.     

连作大豆土壤病原菌的分离及其致病性的研究

在微生物３大类群中,细菌总数在整个大豆生育期内占绝对优势,重茬低于正茬,花期、结荚期尤为明显;放线菌数量总体变幅不大,花期、成熟期重茬高于正茬,而苗期则相反;真菌数量变化很大,重茬高于正茬,花期最为显著。在连作大豆根际土壤中,有益真菌减少,有害真菌增加。将真菌优势菌群中的尖镰孢菌、半裸镰孢菌和粉红粘帚菌回接大豆,均产生不同程度的致病性,导致大豆根腐病的发生,花期前后（３８～５０ｄ）病症明显。３菌株毒素粗提物对大豆毒害性试验结果表明：大豆发芽率显著降低,植株生长受阻。     

我国大豆育种的现状与发展对策

大豆原产于我国,在我国有5 000年的栽培历史,对今天世界大豆的发展起了重要作用。现在美国等国大豆的发展对我国的经济产生巨大冲击,对我国大豆育种提出重要挑战。通过对国内外大豆超高产遗传育种相关研究的进展与发展趋势进行回顾与讨论,提出可行的对策。     

抑制大豆Le1基因表达的RNAi载体构建

本研究采用RT-PCR克隆大豆子粒Le1基因核心保守序列515bp片段,以植物表达载体pCAMBIA1301为基本载体,构建了抑制大豆Le1基因表达的RNAi载体。通过酶切检测及测序,证明表达载体构建正确。本研究为通过RNAi技术降低大豆中凝集素含量,改良大豆品质奠定了基础。     

北方春大豆品系大豆花叶病的鉴定与抗原筛选

为了详细了解我国近几年来育成的北方春大豆品系对花叶病毒病的抗性表现,本研究通过分析2003～2007年的国家北方春大豆品种区域试验和生产试验病毒病2个流行株系(SMV1和SMV3)抗性鉴定数据,筛选兼抗SMV1号和SMV3号株系的抗原有19份,专抗SMV1号株系的抗原55份,专抗SMV3号株系的抗原20份,并发现辽宁省的新品系对2个株系的抗性表现都是最好的,尤其是表现抗病级别(R)的品系较多;而黑龙江省对2个株系的抗性表现都是最差的,尤其是对3号株系,大部分表现感病。建议黑龙江省今后要重视花叶病毒与抗性育种,可以考虑从辽宁和吉林两省引入抗原,进行品种选育和抗性改良。     

我国大豆需求增长的主导因素分析

系统梳理了大豆需求的影响因素体系及影响机制,根据我国近10年来大豆需求变动情况,实证研究了决定大豆需求及进口数量的因素。研究发现,养殖方式向规模化转变,大幅增加了对工业饲料及豆粕的消耗;豆粕需求是大豆国内压榨数量的决定性因素,进而也是我国大豆进口量的标尺性指标。     

大豆豆渣中大豆异黄酮的提取工艺研究

以乙醇为溶剂,以大豆豆渣为原料,研究了大豆异黄酮的提取工艺。结果表明,乙醇浓度、温度、时间、料液比对大豆豆渣中大豆异黄酮的提取均产生不同程度的影响,其中乙醇浓度对大豆异黄酮提取量的影响最大,提取时间对大豆异黄酮提取量的影响最小。通过正交试验得出从大豆豆渣中提取大豆异黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度80%,温度70℃,时间3 h、料液比1∶12,在此条件下异黄酮的提取量为8.95 mg/10 g。