生防细菌K2-1抗菌蛋白纯化及其拮抗水产病原菌分析（英文）

[目的]纯化源自生防细菌K2-1的抗菌蛋白并进行抗菌蛋白于体外对主要水产病原菌的拮抗分析。[方法]利用硫酸铵沉淀,而后透析,获得抗菌蛋白粗品,应用凝胶色谱结合水浴,进一步对抗菌蛋白粗品进行纯化;采用琼脂扩散法,进行抗菌蛋白体外拮抗溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌及鳗弧菌实验,分析其抗菌活性。[结果]应用上述分离纯化方法,获得色谱纯的抗菌蛋白APK2,过程回收率为0.08%,拮抗实验表明,该抗菌蛋白对多数应试病原菌具有较强的抑制作用。[结论]抗菌蛋白APK2有可能作为化学抗生素的替代品,用于水产细菌病的绿色防治。     

利用LAMP法快速检测致病性哈维氏弧菌

从浙江宁波的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) LY-1。从该菌的DNA样本中成功扩增出大小为873 bp的ToxR基因片段。DNA序列分析表明:该序列与已登录哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ToxR基因同源性为96.57%,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguilarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fisheri)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、拟态弧菌(V.mimicus)、河弧菌(V.fluvialis)的ToxR基因相似性为27.62%~72.49%。选择哈维氏弧菌ToxR基因种内保守区段,设计1套环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的特异引物,对扩增条件进行优化实验,在65℃孵育45 min的条件下即可完成哈维氏弧菌特异性扩增,成功建立了海水致病菌-哈维氏弧菌的LAMP快速检测方法。结果分析表明:该方法对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1 fg,比PCR法灵敏度高3个数量级。利用LAMP方法快速检测哈维氏弧菌,目前在国内外还未见报道。     

一株假交替单胞菌DL3的抑菌与群体感应淬灭活性研究

本实验室从水产养殖池防污附钢片的微生物黏膜中分离到一株菌DL3,为了明确该菌株的活性及作为有益菌进行应用的可能,通过细菌分离培养、16S rRNA测序和系统发育分析对其做了初步鉴定,并采用牛津杯法、平板法分别测定了菌株的抑菌活性和群体感应淬灭活性。基于菌株DL3 16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该菌株与解肽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas peptidolytica)NBRC 101021^T的相似性最高,亲缘关系最近,为99.64%;抑菌试验显示,该菌株对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑制作用最强,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希菌(Escherichi coli)、沙门氏菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcus)、志贺氏杆菌(Shigella)、河弧菌(V.fluvialis)、东方弧菌(V.orientalis)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus...     

凡纳滨对虾及养殖水体中弧菌的分离鉴定

采用TCBS选择培养基从广西钦州市、防城港市等地的凡纳滨对虾及养殖水体中分离纯化得到8株细菌,对分离菌株进行生理生化特性鉴定,并对全部菌株16S rRNA基因序列及部分菌株的HSP60基因序列进行克隆、测序,运用Mega 4.1软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树.选取河流弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌各1株对凡纳滨对虾成虾进行人工感染试验.结果表明,菌株S被鉴定为河流弧菌,菌株M1、M2、M3、水1、水2、水3被鉴定为溶藻弧菌、菌株H1被鉴定为哈氏弧菌;溶藻弧菌对对虾成虾的致病性最强,其次是哈氏弧菌.     

乌鳢体表粘液的抑菌作用

分析了乌鳢体表粘液对爱德华氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌3种海洋致病菌的抑菌效果及影响因素。结果表明,同浓度的提取物对不同致病菌的抑菌活性不同,对爱德华氏菌抑制活性最大,其次是溶藻弧菌,最差的是哈维氏弧菌。此外,温度、紫外线和pH对提取物抑制活性都有不同程度的影响。     

2种海洋弧菌的鉴定及人工感染大黄鱼病理分析

从形态学、生化特性、分子生物学水平对2种海洋弧菌进行菌种鉴定,将这2株菌制作成混合菌液,对大黄鱼进行攻毒试验。对2菌株16S r DNA进行PCR扩增,产物长度分别为1 389、1 477 bp。利用BLAST进行比对,结果显示菌株090625的序列与哈维氏弧菌的同源性高达99%;而菌株070925的序列与副溶血弧菌同源性高达99%。攻毒试验发现,大黄鱼体亲鱼表皮下出血和肝脏、脾脏等组织都出现了典型的弧菌感染病症,大黄鱼幼鱼则未出现感染现象。菌株090625为哈维氏弧菌,菌株070925为副溶血弧菌。大黄鱼亲鱼比幼鱼更容易感染细菌。     

鱼源乳酸菌的抑菌特性研究

采用体外试验研究了3株从斜带石斑鱼仔鱼体内分离的乳酸菌其产酸能力及抑菌特性.结果表明:菌株EA-1和Y1B-3产乳酸的速度和pH值下降速度较快,培养后期乳酸含量显著高于Y4-2(P<0.05).3株乳酸菌对致病性哈维氏弧菌和溶藻弧菌均有不同程度的抑制作用,但乳酸对三株乳酸菌的抑菌活性没有影响,提示3株乳酸菌均能产生乳酸以外的抑菌物质.三株乳酸菌的抑菌物质具有一定的热稳定性,经60℃和80℃热处理后保留70%以上的抑菌活性,但经100℃高温处理失去抑菌活性.3株乳酸菌产生的抑菌物质对胰蛋白酶敏感,在偏中性条件下抑菌活性较高.     

鱼源乳酸菌的抑菌特性研究

采用体外试验研究了3株从斜带石斑鱼仔鱼体内分离的乳酸菌其产酸能力及抑菌特性.结果表明:菌株EA-1和Y1B-3产乳酸的速度和pH值下降速度较快,培养后期乳酸含量显著高于Y4-2(P<0.05).3株乳酸菌对致病性哈维氏弧菌和溶藻弧菌均有不同程度的抑制作用,但乳酸对三株乳酸菌的抑菌活性没有影响,提示3株乳酸菌均能产生乳酸以外的抑菌物质.三株乳酸菌的抑菌物质具有一定的热稳定性,经60℃和80℃热处理后保留70%以上的抑菌活性,但经100℃高温处理失去抑菌活性.3株乳酸菌产生的抑菌物质对胰蛋白酶敏感,在偏中性条件下抑菌活性较高.     

中草药对弧菌的抑制作用研究

目的阐明现常用抑菌中草药在水产养殖业的用药疗效,为水产养殖细菌性疾病的防治提供用药参考。方法采用微量肉汤稀释法测定了12种水产养殖常用的抗菌中药产品对5株常见海洋致病菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果 NZ方与市售"虾倍健"抑菌效果最佳,对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、创伤弧菌、哈维弧菌、溶藻弧菌的最低抑菌浓度在0.313~1.250 g/L,而其他市售抗菌中草药大黄末、六味黄龙散、三黄散、根莲解毒散、七味板蓝根散、大蒜素、病毒速灭亡、穿梅三黄散、白头翁口服液、健肝宝和地锦草末对5种海洋致病菌抑制浓度均大于40.000 g/L。结论给水产养殖细菌性疾病的防治提供了用药建议及使用参考。     

大连海区潮间带海藻附生细菌的抗微生物活性

2002、2003年从大连市黑石礁海区潮间带石莼Ulva lactuca、孔石莼Ulva pertusa等10种海藻表面分离得到122株细菌。以11种细菌和1种真菌作指示菌，采用覆盖技术对分离菌株进行拮抗试验，获得拮抗菌74株，占总测试菌株的60．7％。不同时间、不同海藻表面拮抗菌的分离比例不同。拮抗菌的抗细菌比例高于抗真菌比例，且对海洋细菌和陆生细菌均有作用，尤其是40％以上的拮抗菌株对虾的致病菌荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescence、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和费氏弧菌Vibrio fischei有抑制作用。     

海洋源拮抗细菌对水稻纹枯病的防治

从连云港海域的海水和海泥中分离海洋细菌,以水稻纹枯病菌为指示菌对分离到的海洋细菌的抑菌活性进行检测,经过初筛、纯化、定量复筛,获得11株抑菌效果较好的海洋细菌.采用室内抑菌法测定了这11个活性菌株对8种植物病原真菌的抑制效果,结果表明,菌株MG-sm-3、PY-sw-1、PY-sw-9和Ns-sw-6的抑菌谱广且抑菌活性强.用硫酸铵沉淀法提取了这11个活性菌株的胞外粗蛋白,平板抑菌试验结果表明,菌株PY-sw-1的胞外粗蛋白对7种病原真菌的菌丝生长均有抑制效果,尤其对云薹链格孢(Alternaria brassicae)、灰梨孢(Pyricularia grisea)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)有显著抑制作用.田间试验结果表明,菌株PY-sw-1及其胞外物质对水稻纹枯病的防治效果最好,喷施后7 d的防效分别为63.2%和53.9%.以上试验结果说明一些海洋源微生物对植物病害的防治具有一定的功效.     

海绵共附生放线菌的分离鉴定与抑菌活性分析

为了探究海南海绵共附生放线菌资源的多样性及潜在的药用价值，采用 4 种分离培养基分离海南文昌海域海绵的共附生放线菌，利用 16S rRNA序列分析对分离的放线菌进行鉴定，采用滤纸片扩散法对分离放线菌的发酵产物进行抗菌活性分析。结果表明，从4种海绵中共获得50株放线菌，所分离菌株归属于5 个亚目、6个科和 7 个属，包括链霉菌属、小单孢菌属、红球菌属、糖多孢菌、栖白蚁菌属、分枝杆菌属和Krasilnikoviella属，其中Krasilnikoviella为首次从海绵中分离得到，4株海洋放线菌为潜在的新物种。抗菌活性测试显示48%的分离菌株呈现抗细菌活性，24%的分离菌株呈现抗植物丝状病原真菌活性。本研究结果初步揭示了海南文昌海域海绵共附生放线菌的可培养物种多样性及其发酵产物的抑菌活性。     

红树林植物共附生放线菌的分离鉴定及其抗菌活性分析

笔者采用4种分离培养基对10份采集自海南岛西线海岸的红树林植物进行了茎的共附生放线菌分离，并利用16S rRNA序列分析法对分离得到的放线菌进行鉴定，采用滤纸片扩散法对分离得到的放线菌的发酵产物进行抗菌活性分析。结果共分离获得63株放线菌，初步确定16株代表性放线菌的分类地位。16株代表性放线菌中，有13株放线菌属于链霉菌属，有2株放线菌属于小单孢菌属，其中5株链霉菌为潜在的新物种。抗菌活性测试结果显示，16株代表性放线菌的发酵产物对至少1种指示菌具有抗菌活性。从菌株HNM0645的发酵粗提物中分离获得了1个化合物A，经过结构鉴定为已知化合物K-252a。通过测试不同浓度化合物A对山药炭疽病原菌的抑菌率，利用Excel求出毒力回归方程，计算出EC₅₀值为286.61 μg·mL?1，化合物A对供试细菌没有明显的抑菌活性。     

烟台海岸海洋放线菌分布规律及抑菌活性研究

[目的]研究烟台海岸潮间带泥样中放线菌分布规律及抑菌活性。[方法]采用常规分离培养和琼脂块拮抗性测定法。[结果]从烟台海岸潮间带泥样中共分离得到357株放线菌,拮抗细菌的放线菌菌株数比拮抗真菌的多,抗革兰氏阴性细菌的放线菌菌株数较抗革兰氏阳性细菌的多,拮抗青霉的放线菌菌株数多于抗白色假丝酵母的放线菌菌株数;从泥样分离筛选所得的拮抗性放线菌中,中等拮抗性放线菌占多数,而且随着参试靶标菌个数的增加,对靶标菌均有拮抗性的放线菌菌株数却在减少。[结论]为进一步开发利用烟台海岸的海洋放线菌资源奠定了基础。     

大连海区潮间带海藻附生细菌的抗真菌活性

以分离自石莼、浒苔的16株附生真菌作指示菌，采用双层琼脂扩散法，对从石莼Ulva lactuca、孔石莼Ulvap ertusa等10种海藻表面分离的79株细菌进行拮抗试验，获得有拮抗活性的菌株47株，占总测试菌株的59．5％。不同海藻表面拮抗细菌的分布比例不同。研究结果表明，海藻表面的附生细菌可能帮助宿主阻止真菌等表面污损生物的附着。     

香蕉枯萎病拮抗菌的筛选及抑菌作用研究

从香蕉园土壤中分离和筛选得到33株对香蕉枯萎病菌(Fusari um ox ysporumf.sp.cubense)有抑制作用的拮抗菌,对其进行了抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发的试验,结果表明:拮抗菌株G1、G3、F1、F3I、1发酵液对香蕉枯萎病菌的生长有显著的抑制作用,在平板上产生的抑菌圈直径为10.33~48.33mm,抑菌效果持续稳定;对孢子的萌发抑制率为92.50%~98.22%,拮抗菌的抑制作用表现为抑制病菌分生孢子的萌发,致使孢子芽管扭曲。     

番茄内生细菌的分离及拮抗菌的筛选

从太谷、大同等地采集到3个不同品种的番茄健康植株,采用牛肉膏蛋白胨(NA)培养基从根、茎部共分离到65株内生细菌,通过对其中的31株进行平板对峙试验,筛选出对叶霉病菌和灰霉病菌有拮抗作用的菌株6株,占菌株总数的19.4%;对早疫病菌和枯萎病菌有拮抗作用的菌株7株,占菌株总数的22.6%。抑菌圈半径最大可达15 mm。按抑菌圈半径大小,将拮抗菌分为强、中、弱三类。     

防治小麦纹枯病有益内生细菌的筛选

从采自河南西部地区的38份健康小麦根系内分离到小麦内生细菌296株.通过活体植株筛选,从中获得的13株细菌,可显著降低小麦纹枯病的发病率和严重度,其中菌株Z8-15的生防效果最好,防效达到81.82％.在平板上测定了13个菌株对小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌的拮抗能力以及产生葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶等真菌细胞壁降解酶的能...     

砖红镰刀菌拮抗细菌的筛选与鉴定

采用稀释涂布平板法,从尚未发病的玉米田和小麦田土壤里分离得到104株细菌,通过平板拮抗试验获得了5株对砖红镰刀菌具有明显拮抗作用的细菌。通过16S rDNA序列测定、传统形态学和生理生化特性研究,确定这5株细菌均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。研究发现,5株细菌的发酵液对砖红镰刀菌均具有拮抗作用,其中,命名为BS-02的菌株拮抗活性最高,达到61.29%。     

具抗菌活性的红树林细菌的分离筛选

从广西山口红树林保护区采集的样品中分离得到32株细菌,以金黄葡萄球菌为指示菌初筛得到7株细菌具有抗菌活性,同时检测它们对其他4株指示菌的抗菌情况,结果发现SK-01对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉均有明显的抗菌活性。选取SK-01进行初步研究,结果发现SK-01在3号培养基、pH值7.0、盐浓度0的条件下生长最好;在1号培养基、pH值7.0、培养时间48 h、盐浓度1%的条件下产活性物质效果最好;对SK-01进行传代试验,结果显示SK-01具有良好的遗传稳定性,可以进行进一步的开发和利用。