番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

从番鸭肝“白点病”患鸭的肝脾匀浆中分离到7个病毒分离株。在电镜下观察到病毒粒子呈球形，无囊膜，有可见的双层衣壳结构，外壳直径75nm，内核直径50nm；病毒核酸型为RNA；不凝集鸡、鸭、兔、豚鼠红细胞，与禽呼肠孤病毒有一定的抗原相关性；对番鸭胚和鸡胚成纤维细胞可致感染细胞圆缩、融合，出现多核细胞和巨细胞，胞浆内有近核包涵体；试验感染1日龄敏感雏番鸭死亡率达100％，临床及病理变化与自然感染发病的番鸭基本一致，并可回收到该病毒。结果表明，目前国内流行的番鸭肝“白点病”病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒。     

番鸭呼肠孤病毒分子流行病学研究

选取1998～2009年福建省不同地区番鸭中分离到番鸭呼肠孤病毒分离株中具有代表性的10株,用RT-PCR技术扩增其S1和S4基因的功能区片段,进行序列测定.序列分析表明所扩增的S1基因的目的片段为819bp,S4基因目的片段为992 bp.参照国内外已发表的部分毒株S1和S4基因序列,构建番鸭呼肠孤病毒的遗传进化树,分析遗传进化关系.国内各分离株S1基因同源性为92.2％～96.7％,与国外89026株同源性为88.5％～92.8％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为76％～78％.国内各分离株S4基因同源性为95.2％～99.3％,与国外89026株同源性为92.3％～94.5％,与禽呼肠孤病毒S1133株同源性为21.2％～21.5％.通过遗传进化树可以看到MDRV与同属的ARV序列形成了2个大分支,而MDRV序列分为2个小分支:一支为10株分离株和国内分离株,说明国内分离株没有明显差异;一支为国外分离株89026株,这说明国内分离株与国外毒株存在地域差异.     

番鸭呼肠孤病毒弱毒株选育研究

应用番鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)交替传代选育出适应CEF繁殖的番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗株。该弱毒株已失去对1日龄雏番鸭的致病性,对CEF的TCID50稳定在10-5~10-5.5;在雏番鸭体内连续盲传5代,未见毒力返强现象;1日龄雏番鸭免疫不同代次弱毒后7 d攻击番鸭呼肠孤病毒强毒,保护率均在88%以上,且不同代次弱毒的外源病毒检验结果均为阴性。上述结果表明该弱毒株无外源病毒污染、安全性好、遗传性稳定、免疫原性强,可用于制备番鸭呼肠孤病毒病活疫苗。     

番鸭呼肠孤病毒B3株感染对雏番鸭细胞免疫功能的影响

番鸭感染番鸭呼肠孤病毒后,在感染早期(15 d内),外周血淋巴细胞转化率比对照显著下降(P<0.01),外周血T淋巴细胞ANAE阳性率比对照显著下降(P<0.01),IL-2含量也比对照组显著下降(P<0.01);但在感染后期(特别是感染后20 d)各指标均有所回升,但仍显著低于对照.由此可见,番鸭呼肠孤病毒感染早期机体细胞免疫功能受到严重影响,感染后期功能逐渐恢复.     

番鸭呼肠孤病毒在番鸭体内的动态分布和排毒规律

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒在人工感染番鸭体内的动态分布和排毒规律.结果显示在感染后ld可在肝、脾脏、法氏囊、胸腺和盲肠扁桃体中检出病毒RNA,表明病毒首先入侵免疫器官;随后其他器官中逐渐检测到病毒.高峰期为攻毒后7～14 d,所有器官中均能检测到病毒,此时也是病毒感染发病最严重的时间.感染后14 d,在肺和...     

番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定

从番鸭肝“白点病”患鸭的肝脾匀浆中分离到 7个病毒分离株 .在电镜下观察到病毒粒子呈球形 ,无囊膜 ,有可见的双层衣壳结构 ,外壳直径 75nm,内核直径 50 nm;病毒核酸型为 RNA;不凝集鸡、鸭、兔、豚鼠红细胞 ,与禽呼肠孤病毒有一定的抗原相关性 ;对番鸭胚和鸡胚成纤维细胞可致感染细胞圆缩、融合 ,出现多核细胞和巨细胞 ,胞浆内有近核包涵体 ;试验感染 1日龄敏感雏番鸭死亡率达 10 0 % ,临床及病理变化与自然感染发病的番鸭基本一致 ,并可回收到该病毒 .结果表明 ,目前国内流行的番鸭肝“白点病”病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属番鸭呼肠孤病毒     

呼肠孤病毒B3分离株感染番鸭的病理组织学研究

番鸭呼肠孤病毒B3分离株可经滴鼻、饮水、肌肉和爪垫注射与同居感染1日龄敏感番鸭，潜伏期3－11d，死亡率100％；接种1日龄番鸭、半番鸭和雏鸡抓垫可引起注射部位炎性反应，爪垫和肌肉注射1日龄半番鸭和雏鸡不死亡，病毒感染番鸭主要引起肝、脾、心肌、肾、腔上囊、腺胃、肠粘膜下层等组织局灶性坏死；肝、脑血管周围和肾间质、肺间质、心肌间有淋巴样细胞或／和蚕噬细胞聚集，法氏囊淋巴细胞变性和坏死，电镜观察表明，感染胚肝细胞和脾淋巴细胞胞浆内有大量病毒样颗粒及近核包涵体，感染细胞多核化、空泡化及颗粒化；发现含有病毒样颗粒的凋亡细胞；吞噬细胞胞浆内有病毒样颗粒和含病毒样颗粒的调亡小体，此项研究为国内首次报道。     

抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达10³。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物（MDEF）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒（PMV）和鸭肝炎病毒（DHV）均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法（VI）的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。     

一例疑似雏番鸭呼肠孤病毒病的诊治

介绍一例疑似雏番鸭呼肠孤病毒病的发病情况、临床症状、剖检病变,经诊断后提出防治措施,总结诊治体会,以指导该病的防治。     

番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法的建立

根据经典和新型水禽呼肠孤病毒σA基因的保守序列设计一对PCR引物,通过优化病毒RNA提取方法和PCR条件,建立了番鸭呼肠孤病毒通用RT-PCR检测方法。该方法可自1株经典型或4株新型水禽呼肠孤病毒特异性扩增出436 bp条带,其最低病毒检出量为3.6 TCID50,而对鸭甲肝病毒、鸭瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒、番鸭细小病毒、产蛋下降综合征病毒和H9N2亚型禽流感病毒扩增均为阴性。对2011~2012采集的224份(番鸭74、鹅68、鸭82)疑似临床病料进行检测,结果 56份为阳性,番鸭、鸭和鹅阳性率分别为59.5%(44/74),11.0%(9/82)和4.4%(3/68),表明水禽呼肠孤病毒主要在番鸭中流行。     

番鸭呼肠孤病毒感染对体液免疫功能的影响

 【目的】探讨番鸭呼肠孤病毒感染对体液免疫功能的影响。【方法】将60只5日龄健康番鸭,随机平均分为两组,分室隔离饲养。试验组雏鸭每只腿部肌肉注射番鸭呼肠孤病毒细胞毒0.2 mL（0.01个TCID50=10-3.7558）,对照组相同部位注射等量灭菌生理盐水,每隔5 d,应用组织化学法检测脾脏和法式囊中浆细胞数量,间接血凝法检测血清中禽流感抗体水平和放射免疫法检测血清中IL-2,IL-6含量的变化。【结果】番鸭感染呼肠孤病毒,法氏囊和脾脏中浆细胞数量试验组均比对照组少,在感染后15 d达到最少,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）;同时,番鸭感染呼肠孤病毒可抑制禽流感抗体形成,感染后15d抗体水平最低,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）,此后又逐渐升高;血清中IL-2和IL-6的含量也在感染初期降低后又逐渐回升,感染后10 d均达最低,试验组极显著地低于对照组（P＜0.01）。【结论】番鸭呼肠孤病毒感染5日龄雏番鸭,通过破坏免疫器官(法氏囊,脾脏)中的浆细胞,降低了机体抗体形成能力,同时,也通过对免疫分子的影响反过来影响机体的体液免疫功能。提示,增强机体体液免疫功能是防制该病的一个途径。     

应用半套式RT-PCR技术诊断番鸭呼肠孤病毒病

参考GenBank中番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)S1基因序列设计并合成3条引物C1、HP11和HP12,组成半套式RT-PCR,扩增片段为300 bp.应用该半套式RT-PCR对MDRV、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭细小病毒(MPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸡胚成纤维细胞(CEF)和番鸭胚成纤维细胞(MDEF)培养物进行扩增.结果仅能从MDRV中扩增出300 bp特异片段,而不能从ARV、MPV、GPV、CEF和MDEF细胞培养物中扩增出特异片段;该方法检测灵敏度为1 fg核酸,重复性好.对人工感染和临床疑似病例用病毒分离和半套式RT-PCR进行检测,2种方法符合率为100%.因此,该半套式RT-PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒病的临床快速检测.     

番鸭呼肠孤病毒M(M1～M3)基因序列克隆及特性分析

参考Genbank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)中片段基因序列设计合成引物,对MDRV MW9710株中片段M基因RT-PCR扩增后,进行测序和特性分析。结果显示MW9710株M1基因全长2 283bp,与MDRV S14株同源性为99.9%,与ARV同源性小于74%。M1基因仅有1个编码框13～2 211bp,编码μA蛋白,含732个氨基酸。M2基因序列全长2 155bp,与MDRV S14株同源性为99.9%,与ARV同源性小于69%。M2基因仅有1个编码框28～2 058bp,编码外壳μB蛋白。M3基因序列全长1 997bp,而ARVM3基因全长1 996bp。M3基因仅有1个编码框25～1 683bp,编码μNS蛋白。MDRV MW9710株M3基因核苷酸序列与MDRV 89330株的同源性为87.2%,与ARV同源性小于74%。MDRV MW9710株5′末端序列不保守:M1为5′-ACUUUUU,M2为5′-UCUUUUU,M3为5′-GCUUUUU,MDRV MW9710株3′末端序列UCAUC-3′保守。     

法国番鸭与莆田白番鸭杂交的效果

为改善莆田白番鸭的生长速度和肉用性能,本试验选用法国Ｒ５１系番鸭与莆田白番鸭进行二元杂交,通过对杂交后代与亲本的生产性能进行比较．结果表明,７０日龄时杂交番鸭．莆田白番鸭平均体重公鸭分别为２８７０．６ｇ和２６１６．７ｇ,母鸭为１９５４．２ｇ和１７３７．５ｇ,经检验公鸭体重之间存在显著差异（Ｐ＜０．０５）,母鸭体重之间存在极显著差异（Ｐ＜０．０１）,日增重公鸭分别为４０．３１ｇ和３６．６８ｇ,母鸭为２７．２４ｇ和２４．１５ｇ,杂交番鸭与莆田白番鸭的料肉比为３．０７和３．１４．由此可见,杂交番鸭与莆田白番鸭相比,具有生长快,体型大,饲料转化率高等特点,获得了良好的杂交效果．     

番鸭本品种人工授精的技术

通过５００多头次采用母鸭诱情法采精和食指定位法输精，对番鸭本品种人工授精方法、输精量、输精间隔时间、输精时间以及稀释液对受精率影响等进行系列研究．结果表明：番鸭平均采精量为１．０７±０．２６ｍＬ只－１，密度为（１．８５±０．２３）×１０９ｍＬ－１，活力为７．５－９．８；以１６：００－１７：００输精，输精量０．０５ｍＬ只－１，间隔６ｄ输精１次为好，受精率可达８９．１１％；采用人工授精，公鸭利用率比自然交配提高２０倍，可大幅度提高饲养效益；用不同稀释液（生理盐水、蛋黄葡萄糖液和磷酸缓冲液）按１１稀释番鸭精液与原精液输精比较，以磷酸缓冲液稀释组的受精率（９０．０１％）较高，但与原精组受精率（８９．０９％）差异不显著（Ｐ＞０．０５）；用磷酸缓冲液和Ｌａｋｅ液以１１稀释后在２－５℃保存２４ｈ输精，受精率分别为３０．５６％和４５．３２％     

番鸭IFN-α基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法从番鸭肺脏器官中扩增IFN-α基因片段,将扩增产物经胶回收后克隆到pMD18-T 载体上,经PCR和双酶切鉴定为阳性后进行序列测定,并用Lasergene v7.1DNAStar软件对测序结果进行分析.结果表明,所扩增的IFN-α基因编码完整的开放阅读框,基因长度为576 bp,为国内外首次报道.并...     

番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗在番鸭体内中和抗体消长规律的研究

为明确番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗在番鸭体内中和抗体消长规律,采用固定病毒稀释血清法,测定了经弱毒疫苗免疫后的雏番鸭不同时间其血清中和抗体效价。结果显示：疫苗注射1日龄雏番鸭,免疫后28 d部分鸭血清中出现抗体,35 d全部鸭血清中出现抗体;6个月抗体效价达高峰,有效免疫期在18个月以上。表明番鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗诱导的中和抗体产生期较晚,但持续期长。     

抗番鸭细小病毒卵黄抗体的制备

[目的]有效预防和治疗番鸭细小病毒病。[方法]用番鸭细小病毒连续免疫产蛋母鸡3次,收集鸡蛋,并制备出高免卵黄抗体。通过琼脂扩散试验对制备的卵黄抗体进行效价测定,用雏番鸭进行中和与治疗试验。[结果]制备的卵黄抗体琼扩效价达到1∶32,能有效中和番鸭细小病毒对雏番鸭的致病性,对发病的雏番鸭有很好的治疗作用。[结论]该研究为番鸭细小病毒的预防和治疗提供了一种有效的生物制品。