蝴蝶兰PhaSEP3基因的克隆及其在突变体中的表达

E类MADS-box是花器官发育分子模型中必不可少的基因,通过突变体研究其表达模式将为深入理解兰科植物花器官的分子机理与完善花发育调控理论提供依据。采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术从蝴蝶兰花瓣中克隆了一个E类MADS-box基因PhaSEP3(GenBank登录号为MZ436812),并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在蝴蝶兰不同组织和5种突变体中的表达水平。结果表明,该基因cDNA全长为1 236 bp,具有753 bp的开放阅读框(ORF),可编码250个氨基酸,其C端具有SEPⅠ和SEPⅡ基序。系统进化分析显示,该基因编码蛋白质与蝴蝶兰属的PeSEP3和AGL9亲缘关系最近。组织特异表达分析表明,PhaSEP3基因主要在生殖器官和授粉后子房中表达;在不同突变体中,PhaSEP3基因在侧萼唇瓣化突变体的萼片和唇瓣中表达水平显著升高;在退化雄蕊瓣化突变体的侧瓣、唇瓣和子房中表达水平显著降低,在蕊柱中的表达水平显著升高;在侧瓣唇瓣化突变体的侧瓣和唇瓣中表达水平显著升高;在侧瓣退化突变体的侧瓣中表达水平显著降低,而在蕊柱和子房中表达水平显著升高;在侧瓣雄化突变体中,该基因的表达水平在萼片和侧瓣中均显著升高。分析认为,PhaSEP3基因主要调控蝴蝶兰花器官各轮组织与授粉后子房的发育,在突变体花器官中,PhaSEP3类基因可能与其他花发育基因互作参与花器官形态的发育调控。该研究结果为进一步理解兰科植物花器官多样性的调控机理提供了资料。     

水稻花器官数目异常突变体afon1的表型分析与基因定位

【目的】研究水稻花器官数目异常突变体afon1(abnormal floral organ number1)的分子机理,鉴定出控制水稻花器官数目变化的基因。【方法】利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种浙农34获得一个花器官数目异常突变体作为试验材料,命名为afon1。开花期随机取突变体afon1和野生型浙农34的稻穗各5个,利用组织学和扫描电子显微镜等技术研究afon1的花器官表型、细胞学特征和花粉育性。成熟期随机取突变体afon1和野生型浙农34植株各10株,测定株高、分蘖数、穗长、每穗颖花数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状。随机取突变体afon1和野生型饱满种子各100粒,测定发芽势和发芽率。以突变体afon1为母本,分别与野生型浙农34和粳稻品种浙农大104杂交构建2个F2群体进行遗传分析和基因定位,筛选候选基因进行DNA测序比对,构建AFON1蛋白质的空间模型并对其结构进行分析,同时对候选基因以及与花器官数目相关的基因进行实时荧光定量PCR分析。【结果】与野生型相比,突变体afon1中59.64%小穗的花器官数目发生异常,其中多数小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状的器官,部分小穗表现2—4轮花器官数目同时增加;株高和千粒重显著增加,而结实率显著降低。遗传分析表明,突变体afon1与野生型浙农34杂交的F1植株小穗花器官数目表现正常,F2群体中小穗花器官数目正常植株与花器官数目异常植株的分离比符合3﹕1,表明突变体afon1性状受一对隐性核基因控制,基因位于水稻第1染色体长臂端In Del标记1M5和1M18之间,物理距离为73 kb,该区间内共有6个注释基因。突变体afon1和野生型的测序比对发现,突变体afon1中的基因LOC_Os01g67430外显子中第565个碱基T突变成A,导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。蛋白质序列和空间结构分析表明,AFON1蛋白质序列中含有一个Lipase_3结构域,结构域内的突变导致蛋白质的空间结构发生了明显的变化。实时荧光定量PCR结果显示,LOC_Os01g67430在突变体afon1幼穗中的表达量要显著高于野生型,而在根、茎和叶中则无显著差异;穗发育早期FON1和FON2/4等调控花器官数目的基因在突变体afon1花器官中的表达量显著增加。【结论】LOC_Os01g67430为突变基因afon1,该基因通过影响花器官数目相关基因的表达而调控各轮花器官数目。     

水稻开颖半不育突变体的观察、遗传分析和基因定位

【目的】通过对一份航天诱变水稻（Oryza sativa L.）开颖半不育突变体ohss（open-hull semi-sterility）进行形态特性调查、遗传分析和基因定位,筛选候选基因,为下一步基因克隆和功能分析奠定基础。【方法】以籼稻品种航恢七号为材料,通过“神舟八号”飞船搭载,诱变获得一份水稻开颖半不育突变体ohss。对其进行形态特征解剖观察,分析颖花器官发育突变特点。调查突变体和野生型的花粉可育率、自然结实率和套袋自交结实率,对其育性进行鉴定。随机选取5个成熟单株,考察穗部谷粒相关性状并进行统计分析。通过覆盖全基因组的SSR分子标记检测,解析空间诱变的分子变异效应。以航恢七号、Francis和02428与突变体ohss配制杂交组合,观察F₁和F₂植株的花器官表型,进行?²测验,对突变性状进行遗传分析。以02428/ohss的F₂分离群体作为目标基因定位群体,同时利用SSR标记以及新开发的多个InDel分子标记开展基因定位研究。利用RAP水稻基因组注释数据库对定位区间的候选基因进行预测,通过序列比对和基因表达分析筛选候选基因。【结果】开颖半不育花器官突变体ohss与野生型相比,抽穗期穗部明显包茎,颖花发育出现异常,内外稃片瘪弱、扭曲变形且开裂不抱合,颖花内部发育类似内稃状的器官,部分颖花没有内稃的分化。ohss发育异常颖花中可育花粉率58.74%,导致单株结实率、穗重、穗实粒数与野生型相比极显著降低。全基因组SSR标记检测表明突变体ohss总变异频率为0.0336,除了第7、12染色体未检测到突变位点,其他染色体上检测到突变频率范围为0.0143-0.0889。遗传分析结果显示ohss的开颖半不育表型受单隐性核基因ohss(t)控制,并将ohss(t)定位在水稻第3染色体上2个InDel标记InDel6043和InDel6070之间约27.6 kb的物理距离内。该区域有3个预测注释基因,序列比对和表达分析表明突变体ohss的OsMADS1编码区及启动子序列未发生突变,但是表达模式发生强烈改变。【结论】开颖半不育的花器官发育突变体ohss受单隐性核基因ohss(t)控制,ohss(t)定位在水稻第3染色体上InDel6043和InDel6070标记之间约27.6 kb的物理距离内,其OsMADS1的编码序列及5′UTR区未发生碱基突变但表达受到强烈抑制。     

水稻花发育研究进展

迄今为止,双子叶植物花发育模型研究已基本成熟,这些模型在一定程度上也适用于水稻等单子叶植物的研究.目前,已鉴定克隆了部分与水稻花发育相关的基因,如水稻稀穗LAX、PLAI、LHD、FZP、CL、RFL、RAP1A和RAP1B基因以及花器官发育的水稻ABCDE 5类功能基因和花序变异基因包括Lax、Fzp、OsCKX2、Fon1等,促进了人们对水稻花发育机制的进一步了解.但是有关水稻花发育特异基因之间的调控及作用机理尚未清楚,今后需采用以先进的生物技术为手段,通过分离、鉴定更多的水稻花发育突变体基因,深入探讨各个基因的功能及相互作用,最终系统了解水稻花发育调控机理,从而为深人研究单子叶花序发育奠定基础.     

水稻矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2 (ddf2)的基因定位与候选基因分析

【目的】对一个同时导致营养和生殖器官发育异常的水稻突变体进行表型鉴定、基因定位和候选基因分析,为下一步的基因克隆与功能分析奠定基础。【方法】在水稻籼型恢复系602组织培养后代中,发现一个矮化并花发育异常突变体dwarf and deformed flower 2（ddf2）。抽穗期,以野生型为对照,对ddf2株高、主穗长、节间和功能叶的长宽等性状进行统计分析;同时利用冷冻切片等技术对茎、叶和花器官进行详细的形态和组织学分析。分别以西农1A和中花11为母本,以DDF2/ddf2杂合株系为父本构建2个F₂群体进行遗传分析和基因定位,并对候选基因进行实时荧光定量PCR（real-time PCR）分析。【结果】相较于野生型,突变体各节间的长和茎粗均极显著降低,叶片极显著变短、变窄,同时花序也极显著变短。组织细胞学分析发现,突变体大叶脉数目和相邻2个大叶脉之间的小叶脉数都没有明显的变化,但相邻2个大叶脉之间的宽度明显减小,进一步比较2个小叶脉之间的叶肉细胞,发现在突变体中细胞数目和尺寸均显著降低;突变体茎秆维管束的数目与野生型相比没有明显的变化,但统计发现2个大维管束之间基本组织细胞的数量和细胞的大小都显著小于野生型,表明ddf2突变体茎、叶细胞分裂和膨胀都受到了抑制;此外,ddf2突变体的花器官特征发育受到了严重干扰：第一轮外稃顶部弯曲、内稃不同程度退化,第三轮雄蕊器官严重退化,部分甚至转化为雌蕊状器官,另外部分ddf2小穗的护颖过度发育,转变成稃片状,一些小穗还表现分生组织确定性的丢失,发育出2个以上的小花。遗传分析表明该突变性状受1对隐性基因控制。利用中花11/ddf2的1 024株F₂分离群体,最终将DDF2精细定位在第11染色体短臂近着丝粒位置处,位于insertion/deletion（in/del）标记S-11和S-14之间,遗传距离分别为0.049和0.098 cM,物理距离为90.295 kb,并与标记S-24共分离。分析定位区间的基因,发现共有MSU注释基因12个,其中一个编码Sec3_C蛋白的LOC_Os11g17600内部包含共分离标记S-24,进一步对该基因进行表达分析,发现该基因在突变体的叶、茎和穗中都表现出明显的下调,初步将LOC_Os11g17600作为DDF2候选基因。【结论】DDF2是一个同时控制水稻茎/叶和花器官发育的新基因。     

水稻短穗小粒突变体sps1的鉴定与基因精细定位

【目的】通过对一个水稻短穗小粒突变体的鉴定与基因精细定位,为水稻等禾本科作物的籽粒发育及分子改良奠定基础。【方法】在水稻EMS诱变体库中鉴定到一个短穗小粒突变体,暂命名为sps1（shorten panicle and seed 1）。成熟期观察野生型和sps1的形态变化,考察株高、节间长、穗实粒数、结实率和千粒重等农艺性状;对野生型和sps1籽粒外稃内外表皮中部进行扫描电镜观察,并利用石蜡切片进一步分析野生型和sps1籽粒的形态变化;配制缙恢10号/sps1杂交组合进行遗传分析,并利用其F₂群体进行基因精细定位;对野生型和sps1两叶一心期的叶鞘进行油菜素内酯（brassinolide,BR）敏感性试验;抽穗期分析SPS1在水稻根、茎、叶、鞘和穗中的表达,并对籽粒发育相关基因和BR相关基因进行qPCR分析。【结果】sps1穗和倒1、2、3的节间长度均极显著短于野生型,导致株高半矮化;此外,sps1穗枝梗数、结实率和千粒重也显著降低;扫描电镜观察发现sps1外稃中部内外表皮细胞长度极显著小于野生型,宽度则极显著变大,石蜡切片观察进一步证实了sps1籽粒宽短是由细胞变短、变宽造成的;籽粒发育相关基因qPCR分析发现,部分通过调控细胞分裂和扩展进而影响水稻籽粒发育的基因表达量发生了显著变化,在sps1中,AFD1、SLG、HGW和GS3的表达量显著上调,GW7和GID1显著下调;选取符合3﹕1分离比例的F₂代分离群体中的突变单株进行基因定位,最终将调控基因精细定位在第7染色体上标记sps1-3和sps1-2之间134 kb的物理范围内,包含19个注释基因;经测序,与野生型相比,发现sps1中的Os07g0616000在编码区有一个A-T的碱基替换,致使编码的赖氨酸变成了终止密码子,导致蛋白翻译提前终止,初步确定为候选基因。qPCR分析发现SPS1在水稻的根、茎、叶、鞘和穗中均有表达,且在茎秆中的表达量最高;生物信息学分析发现,SPS1是DEP2的一个新等位基因。sps1对外源BR的敏感性降低,BR钝感基因D1的表达极显著下调;推测SPS1/DEP2可能通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。【结论】sps1是一个水稻短穗小粒突变体,SPS1编码一个表达蛋白,是DEP2的新等位基因,通过BR信号传导途径调控水稻籽粒和株型的发育。     

白桦BpMADS3 基因的功能分析

利用RT鄄PCR 技术,揭示了BpMADS3 基因在白桦不同组织中的差异表达模式:BpMADS3 基因仅在花器官中 强烈表达,在茎、叶组织中不表达。采用染色体步移法克隆BpMADS3 基因上游启动子,获得1 426 bp 长度启动子序 列,构建BpMADS3 基因启动子驱动GUS 基因植物表达载体,在拟南芥转基因植株中GUS 染色表明,GUS 活性集中 在萼片和心皮中。在拟南芥ap1 突变体中过量表达BpMADS3 基因,能恢复拟南芥ap1 突变体花器官的正常发育。 BpMADS3 基因转化烟草发现,转基因植株出现早花表型,且转基因烟草植株中相关开花基因表达水平均上调。      

欧洲千里光SvAPETALA1基因的克隆及功能分析

  目的  花器官发育是影响花观赏价值的重要因素,AP1类基因调控植物花器官的形成。研究菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris的SvAP1基因在花器官形成中的重要作用,旨在探究菊科复杂花序结构产生的调控机制。  方法  以欧洲千里光为材料克隆获得了SvAP1基因,通过多序列比对、构建系统进化树、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)反应、构建超表达载体、组织学染色观察等方法与技术,对SvAP1基因进行功能预测与分析。  结果  SvAP1基因开放阅读框长度为705 bp,编码234个氨基酸。多序列比对与系统进化分析显示:SvAP1基因属于MADS-box基因AP1类亚家族,C末端具有paleoAP1保守基序(motif)。欧洲千里光组织特异性表达分析表明:SvAP1基因在营养器官和花序中都有表达。转基因龙葵Solanum nigrum的形态学观察和石蜡切片技术分析显示:与野生型龙葵相比,转基因龙葵雌蕊发育异常,表现为子房膨大且雌蕊状组织增多。  结论  欧洲千里光SvAP1基因在龙葵中的超表达影响雌蕊发育,与ABC模型中A类基因超表达对植物花器官发育造成的影响存在差异,即转基因龙葵雄蕊无明显变化且雌蕊未转变为萼片状或叶片状器官。这可能与欧洲千里光花器官调节机制和花序结构的复杂性有关。由此可知,欧洲千里光SvAP1基因可能作为花器官特征基因在花器官形成中具有重要作用。图6表1参35     

2种水稻OsRhoGDIs基因在幼穗组织中的原位杂交分析

水稻OsRhoGDI1和OsRhoGDI2基因是通过酵母双杂交技术从幼穗中分离的新基因,其编码产物是与水稻Rho蛋白OsRacD相互作用的一类活性调控蛋白。为研究这2种OsRhoGDIs基因在幼穗组织中的表达特点,通过PCR扩增的方法制备了探针模板,并采用随机引物标记的方法,以地高辛对探针进行了标记,进而利用这2种探针与水稻幼穗组织石蜡切片进行RNA原位杂交,结果表明,OsRhoGDI1和OsRhoGDI2在幼穗组织中都有表达,但OsRhoGDI2基因的转录水平明显高于OsRhoGDI1基因,提示OsRhoGDI2可能是调控OsRacD活性的主要类型。     

水稻Ds插入易倒伏突变体的形态和生理鉴定

为了从形态学和生理学角度初步分析水稻Ds插入突变体出现倒伏的可能原因,继而为进一步开展水稻倒伏相关基因的功能研究提供参考,比较了该突变体与野生型在株高、茎上各主要节间的长度、粗度、茎壁厚、叶鞘厚度以及根、茎、叶片、叶鞘、穗和稃片中纤维素和硅含量的差异.结果显示,易倒伏突变体各主要器官中纤维素含量均明显下降,硅在各器官中的分配方式也出现不同于野生型的变化.研究表明,各器官中纤维素含量下降引起的植株机械强度减弱可能是导致突变体易于倒伏的主要原因.     

裸粒水稻花序和小穗的发育进程研究

裸粒水稻是水稻和小麦远缘杂交的产物袁此前的研究已表明OsMADS1基因功能的改变是其特有花部性状的主要原因袁但目前仍对其花序和小穗的发育进程缺乏详细的认识遥通过扫描电镜观察袁发现从枝穗分化期至顶端小花内外稃分化期袁裸粒 水稻的发育仍与水稻没有明显区别袁但在其后花器官的发育上较为紊乱袁花器官确定性丧失袁从而产生额外的花器官和次级小穗遥这些观察有助于更好地理解裸粒水稻形态变异的分子机理遥     

水稻PDL2的突变导致小穗外稃退化

【目的】小穗是禾本科植物特有的花器官。在水稻中，小穗作为花序的基本单位和独有结构，对水稻的产量和品质具有重要影响。因此，研究水稻小穗和花器官的发育，为水稻产量和品质的形成提供依据。【方法】使用甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变籼稻保持系西农1B，获得2个具有相似突变表型的水稻等位突变体polarity defect of lateral organs 2-1和polarity defect of lateral organs 2-2(pdl2-1和pdl2-2）。由于二者表型相似，选取pdl2-1（命名为pdl2）为材料，通过显微观察和石蜡切片技术分析其小穗突变表型；通过农艺性状考察分析小穗外稃突变对水稻产量的影响；通过图位克隆技术验证PDL2的功能；运用原位杂交技术及实时荧光定量PCR(RT-qPCR）技术分析PDL2的表达模式。【结果】表型分析结果表明，与野生型相比，pdl2突变体外稃明显变窄，不能与内稃紧密钩合，导致小穗开裂，内轮花器官部分裸露在外，但其雄蕊、雌蕊和浆片的形态和数量均表现正常。进一步的石蜡切片结果表明，突变体外稃硅化细胞和泡...     

水稻生殖发育进程与小穗外部形态的对应关系

以粳稻品种中花11为材料,对其雌蕊、雄蕊发育的细胞学进程与其相应的小穗外部形态进行分析,获得了该品种雌雄蕊发育的大、小孢子母细胞、减数分裂、孢子形成和配子体发育等各个时期与颖花稃片长度的对应关系。随着稃片长度的不断增加,其颜色逐渐由白色转为嫩绿色,稃片最终长度达6.4mm时,雌蕊(胚囊)和雄蕊(花粉)发育成熟。同时还对中花11种子发育和颖果及稃片的形态学对应关系进行了分析,总结了胚胎和胚乳发育进程与颖果及稃片长度和形态的关联性。颖果和稃片的发育呈阶段性的变化,当胚囊授粉后9d时,颖果和稃片均发育伸长至6.71、7.34mm,达到最大值后颖果和稃片不再伸长,主要进行横向加宽发育,直至成熟。     

水稻裂颖突变体srg花器官突变的形态发生及遗传分析

在水稻Lemont×Dular的重组自交系群体(RILs,F10)中发现了裂颖突变体(split rice glume,srg).利用扫描电子显微镜观察野生型水稻和裂颖水稻的颖花原基分化情况,结果发现,突变体水稻的幼穗在形成内、外稃原基后,有些颖花在形成浆片后并不是直接发育形成雄蕊原基,而是在外稃或内稃原基内侧又分化出浆片原基;有些颖花原基从中间缢裂,缢裂的颖花原基又分别形成类稃片的结构,颖花发育后期,6枚雄蕊发育畸形,并且观察到不同数目的雄蕊.同时以突变体作母本,Dular、Lemont为父本配制杂交组合进行遗传分析,F2表型和χ2测验结果表明,该突变性状受单基因隐性控制.     

云南黄连花粉活力和柱头可授性研究

 通过扫描电子显微镜观察花粉粒的形态特征,采用I2-KI染色法测定云南黄连花粉活力,并通过联苯胺+过氧化氢反应液和3%的过氧化氢测定其柱头可授性。结果表明：云南黄连的花粉粒为近圆球形,具有萌发孔,表面具有刺状雕纹;花粉活力一天中最强的时间段是13∶30—15∶30,最强的时期是散粉时期;I型（雌蕊长于雄蕊）的云南黄连柱头可授性高于II型（雄蕊长于雌蕊）的。在散粉初期,云南黄连普遍具有较高的柱头可授性。     

“萍乡显性雄性核不育水稻”酯酶同功酶的研究初报

“萍乡显性雄性核不育水稻”是一种自然突变株,通过对可育株、不育株及珍A不育系的雄芯,雌芯及不同发育时期功能叶的酯酶同功酶进行一系列的比较研究,找出了酯酶同功酶各器官组织中的变化规律,发现了“萍乡核不育水稻”可育株与不育株的雄芯酯酶同功酶有明显的差异,还发现雌芯的酯酶同功酶尚无差异,功能叶未见差异。     

芝麻花序和花发育规律的初步研究

通过对芝麻花序及花的发育规律进行系统的解剖学研究结果表明：芝麻第一花序原基发生于第２叶展平，第３叶露心时。花序原基在叶腋形成后，两侧先分化出苞叶原基，接着顶端变为花原基，花序中成花的数目与花序原基的表面积呈正相关，原基表面积大，分化花的数目多，反之则少。花原基顶端变平加宽后由外向内依次分化出花萼、花瓣和雄蕊、雌蕊。整个花芽分化可以划分为花序原基形成期、苞叶分化期、花萼分化期、花冠和雄蕊分化期以及雌蕊分化期５个时期。     

Flower Development and Anatomy of Agapanthus praecox ssp. orientalis （Leighton） Leighton

Floral buds of Agapanthus praecox ssp. orientalis were observed under dissecting and optical microscope to characterize floral organs development and to study relationships between anther development and microsporogenesis. Floral organs differentiation was comprised of 6 distinct stages including nought differentiation, inflorescence bud differentiation, floret primordia differentiation, tepal primordia differentiation, stamen primordia differentiation, and pistil primordia differentiation. Six tepals differentiated almost simultaneously which cross arranged in space and appeared in hexagonal distribution pattern. Six stamens were differentiated inside the tepals at the same time. Finally, 3 carpel primordia differentiated and formed syncarpous pistil. The whole process of floral bud differentiation took approximately 40 d with the first 3 stages developing more slowly than the later 3 stages. Morphology and color of the anther underwent obvious changes during the period between stamen primordia differentiation and anther maturation. Microspores also underwent significant development during this same interval. The relationship between the process of microsporogenesis and anther development has already been made clear by the squash technique.     

利用籼粳稻特异InDel标记分析云南糯稻品种的籼粳特性

利用籼粳杂种优势是实现水稻超高产育种目标的重要途径之一。利用根据粳稻日本晴和籼稻93-11基因组序列设计的34对特异性插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)引物,对采自云南省7个地州17个县的181份糯稻品种进行籼粳性分析。通过对这些糯稻品种DNA样品在这34个InDel位点上的籼型或粳型基因频率,确定各个糯稻品种的籼、粳性。结果表明:141份测试品种被鉴定为典型籼稻,18份为籼稻,8份为典型粳稻,13份为粳稻,1份为偏粳稻。主成分分析表明,云南糯稻籼粳分化明显。     

雷竹无限制花序的形态建成

利用扫描电镜和常规石蜡切片技术对雷竹无限制花序的形态建成进行了研究。结果表明,雷竹无限制花序形态建成过程可划分为花序主轴分化期、第一级侧生假小穗及顶端小穗分化期、颖花原基分化期、雌雄蕊形成期、生殖细胞形成期及假小穗继续形成期;各分化时期是连续的,并有重叠。