利用PRNP-/-羊制备朊蛋白多克隆抗体及其特性分析

【目的】利用朊蛋白双基因敲除（PRNP-/-）羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白（PrP）原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获得了大量的朊蛋白特异性抗血清,间接ELASA检测抗血清中朊蛋白多克隆抗体的效价为25600;Western-blot检测显示所制备抗体不仅可以识别鼠、牛、羊脑组织内源性朊蛋白,而且能识别鼠脑组织内朊病毒。【结论】PRNP-/-转基因山羊可用于制备大量高亲和力朊蛋白多克隆抗体,获得的抗体可用于多种动物朊蛋白及朊病毒类疾病的检测。     

人、牛和羊叠朊基因的表达及牛叠朊蛋白抗血清的制备

叠朊（Dpl）是朊蛋白（PrP）的横向同源物，两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清，以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因，将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a（4-）上，将重组表达载体转入E.coli BL21（DE3）pLys S，IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔，制备牛Dpl的抗血清，SDS—PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E．coli中获得了高效表达。用Ni—NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物，ELISA和West—blot分析表明，制备的牛Dpl抗血清与重组人、牛和羊的Dpl以及牛和羊睾丸组织的Dpl发生了特异性反应，却不与重组人、牛和羊的PrP发生反应。上述结果表明制备的Dpl抗血清可以作为人、牛和羊Dpl的检测试剂和研究材料。     

抗朊蛋白单克隆抗体的免疫学特性研究

以牛、羊重组朊蛋白(PrP)、正常牛、羊的脑组织匀浆、牛海绵状脑病(BSE)及羊痒病阳性的脑组织匀浆及切片为抗原,测定9株抗朊蛋白单克隆抗体的ELISA、免疫印迹及免疫组化等免疫学反应特性.结果表明:5株单抗可用于BSE及羊痒病的ELISA、免疫印迹检测;3株单抗可用于BSE及羊痒病的免疫组化检测;1株单抗在免疫印迹试验中只与羊痒病PrP~(Sc)的核心片段反应,结合该株单抗所识别的抗原表位PrP第78～93氨基酸(aa),证实BSE与羊痒病PrP~(Sc)的蛋白酶K消化位点存在差异.     

水牛朊蛋白成熟片段基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析水牛朊蛋白（prion protein，PrP）成熟片段基因，并获取纯化的表达产物。【方法】将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a，并分析其序列；把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3)，鉴定纯化的表达产物。【结果】水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上，并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列，编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后，用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活性。【结论】首次报道了克隆、分析水牛朊蛋白成熟片段基因，发现水牛成熟PrP有5个重复序列，并获得了具PrP抗原活性的水牛成熟PrP融合蛋白。     

基于抗原表位烟草环斑病毒单克隆抗体的制备

基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白抗原表位所在的结构域,明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸残基附近。通过RT-PCR扩增出了目的片段,构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体,表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性。采用杂交瘤细胞技术,利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体,制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应。检验结果表明,制备的抗血清具较好的特异性,可应用于TRSV的检疫检验。     

Monoclonai antibody preparation of Tobacco ringspot virus based on antigenic epitopes

基于多种生物信息学软件综合预测烟草环斑病毒(TRSV)外壳蛋白抗原表位所在的结构域,明确了该外壳蛋白抗原表位可能位于C端319～328、384～388、420～430、480～487、495～511位氨基酸残基附近.通过RT-PCR扩增出了目的片段,构建了TRSV外壳蛋白原核表达载体,表达的TRSV外壳蛋白外源融合蛋白具免疫活性.采用杂交瘤细胞技术,利用外源融合蛋白制备了单克隆抗体,制备的抗血清可与TRSV外壳蛋白基因原核表达产物发生免疫反应.检验结果表明,制备的抗血清具较好的特异性,可应用于TRSV的检疫检验.     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

小鼠激活素受体相互作用蛋白2的原核表达及抗血清制备

[目的]克隆小鼠激活素受体相互作用蛋白2（ARIP2）cDNA序列，利用大肠杆菌表达ARIP2，制备兔抗小鼠ARIP2的多克隆抗血清。[方法]采用RT-PER方法，将小鼠ARIP2基因克隆到pET-32a（＋）质粒，构建ARIP2原核表达载体并转化到大肠杆菌，IgrG诱导融合蛋白的表达，经亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白，免疫家兔后制备ARIP2抗血清，分别采用ELISA，Western blot检测抗体效价和特异性。[结果]测序结果表明重组质粒pET32a（＋）-ARIP2构建成功；SDS-PAGE分析表明获得的重组蛋白为可溶蛋白；经过亲和层析后得到有效分离；Elisa法测定的抗血清效价为1：50000；Westernblot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。[结论]成功将ARIP2进行了原核表达并制备了高效价、高特异性的兔抗小鼠ARIP2抗血清，为进一步研究ARIP2功能提供了有力工具。     

BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

小鼠抗人ABHD16A多克隆抗体制备

克隆并原核表达人含α/β水解酶结构域丝氨酸酶16A(ABHD16A)基因,制备小鼠抗ABHD16A多克隆抗体。采用反转录PCR克隆ABHD16A的cDNA序列,对该序列进行同源性分析,将克隆的ABHD16A cDNA序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)导入E.coli BL21(DE3)进行原核表达,将纯化ABHD16A的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗血清。研究结果显示,人ABHD16A cDNA序列长度为1 677 bp,序列高度保守,并具有保守的脂肪酶样基序和相应的功能区,原核表达的重组ABHD16A蛋白免疫小鼠后制备的多克隆抗血清在1∶5 000的稀释度具有较好的抗原抗体结合活性。成功制备了小鼠抗人ABHD16A多克隆抗体。     

拟南芥叶绿体血红素加氧酶AtHO1基因的克隆和多克隆抗血清制备

为研究叶绿体血红素加氧酶HO1的生物学功能和分子作用机制,构建了拟南芥血红素加氧酶基因AtHO1的重组融合蛋白表达载体pET28a-AtHO1,质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,AtHO1的重组融合蛋白获得了高效表达,分子质量为28～36ku,且为可溶蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析法纯化后,得到纯度较高的蛋白。纯化产物免疫新西兰大耳兔获得了专一识别重组蛋白6×His-AtHO1的抗血清,进一步提取拟南芥和水稻叶片总蛋白,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28～36ku之间出现特异性条带,证明用重组蛋白6×His-AtHO1制备的多克隆抗血清可以与拟南芥和水稻HO1蛋白特异性结合,说明拟南芥HO1的抗血清能够用于水稻HO1的功能分析和应用研究。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。     

1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。     

Facilitated cross-species transmission of prions in extraneural tissue

Prions are infectious pathogens essentially composed of PrP(Sc), an abnormally folded form of the host-encoded prion protein PrP(C). Constrained steric interactions between PrP(Sc) and PrP(C) are thought to provide prions with species specificity and to control cross-species transmission into other host populations, including humans. We compared the ability of brain and lymphoid tissues from ovine and human PrP transgenic mice to replicate foreign, inefficiently transmitted prions. Lymphoid tissue was consistently more permissive than the brain to prions such as those causing chronic wasting disease and bovine spongiform encephalopathy. Furthermore, when the transmission barrier was overcome through strain shifting in the brain, a distinct agent propagated in the spleen, which retained the ability to infect the original host. Thus, prion cross-species transmission efficacy can exhibit a marked tissue dependence.     

Reversible conversion of monomeric human prion protein between native and fibrilogenic conformations

Prion propagation involves the conversion of cellular prion protein (PrPC) into a disease-specific isomer, PrPSc, shifting from a predominantly alpha-helical to beta-sheet structure. Here, conditions were established in which recombinant human PrP could switch between the native alpha conformation, characteristic of PrPC, and a compact, highly soluble, monomeric form rich in beta structure. The soluble beta form (beta-PrP) exhibited partial resistance to proteinase K digestion, characteristic of PrPSc, and was a direct precursor of fibrillar structures closely similar to those isolated from diseased brains. The conversion of PrPC to beta-PrP in suitable cellular compartments, and its subsequent stabilization by intermolecular association, provide a molecular mechanism for prion propagation.     

Prevention of scrapie pathogenesis by transgenic expression of anti-prion protein antibodies

Variant Creutzfeldt-Jakob disease and bovine spongiform encephalopathy are initiated by extracerebral exposure to prions. Although prion transmission from extracerebral sites to the brain represents a potential target for prophylaxis, attempts at vaccination have been limited by the poor immunogenicity of prion proteins. To circumvent this, we expressed an anti-prion protein (anti-PrP) mu chain in Prnp(o/o) mice. Transgenic mice developed sustained anti-PrP titers, which were not suppressed by introduction of Prnp+ alleles. Transgene expression prevented pathogenesis of prions introduced by intraperitoneal injection in the spleen and brain. Expression of endogenous PrP (PrP(C)) in the spleen and brain was unaffected, suggesting that immunity was responsible for protection. This indicates the feasibility of immunological inhibition of prion disease in vivo.     

小尾寒羊骚痒病单抗制备及免疫组化检测方法的初步建立

【目的】通过表达羊PrPc核心片段、单抗制备，最后建立免疫组织化学检测羊痒病方法。【方法】用PCR方法从小尾寒羊基因组DNA中扩增编码PrPc核心片段DNA， 并克隆到硫氧还原蛋白融合表达载体pET-32a（+）上，转化至E.coli BL21，IPTG诱导融合表达。以纯化的重组小尾寒羊PrPc核心片段免疫PrPc基因敲除小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备羊核心片段单克隆抗体。【结果】通过上述方法，得到相对分子质量约为35 kD的重组小尾寒羊PrPc核心片段，筛选出六株能稳定分泌针对小尾寒羊PrPc核心片段特异单抗的杂交瘤细胞株。免疫组化试验表明,其中4株可特异性识别羊痒病脑组织切片中耐PK酶消化的PrPsc，经5次重复试验表明：所制备单抗与对照单抗F89结果完全一致。【结论】利用原核表达，单抗制备等技术制备出PrP特异性单克隆抗体，用笔者自己研制的单抗作为核心试剂初步建立了羊痒病免疫组化检测方法。     

细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为：当A600为0.6时,以0.3 mmol•L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg•L-1。Western blotting 检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到 1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。