西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因连锁标记开发

【目的】开发与栽培西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因Fon-1紧密连锁的分子标记,为开展西瓜抗枯萎病分子辅助育种提供技术支撑。【方法】以栽培西瓜抗枯萎病品种Calhoun Gray为父本,感病品种Black Diamond为母本杂交获得的F2分离群体为供试材料,采用BSA法对Fon-1基因进行区间定位。依据11份栽培西瓜重测序信息,获取位于定位区间内的候选SNP位点。针对候选SNP位点设计CAPS/dCAPS标记,通过F2代分离群体和种质资源验证上述标记与Fon-1基因的连锁关系。【结果】通过BSA法,将Fon-1基因定位于1号染色体15 cM区间内。利用候选SNP位点信息,开发3个CAPS/dCAPS标记7716_fon、7419_fon和4451_fon,F2代分离群体以及164份西瓜育种材料验证显示,上述3个标记与Fon-1基因的连锁距离分别为0.8、1.0和2.8 cM。【结论】利用栽培品种Calhoun Gray的抗性遗传机制,开发的3个CAPS/dCAPS标记可以有效区分栽培西瓜对枯萎病菌生理小种1的抗病、感病性,为栽培西瓜品种枯萎病菌生理小种1抗性基因快速应用于栽培品种枯萎病抗性改良建立有效的技术手段。     

西瓜抗枯萎病育种的分子辅助选择（英文）

利用国内公开发表的西瓜抗枯萎病生理小种1基因紧密连锁标记4451_fon,首次对我们抗枯萎病育种选出的二倍体和四倍体种质进行了分子鉴定,结果表明,全部二倍体单系和四倍体单系均表现为抗病基因型,判定为抗病材料,与人工接种鉴定结果完全一致;分子鉴定还表明,这些抗病单系为抗病纯合体,在以后的自交纯化过程中抗性基因不再分离和丢失,因此不必继续对其自交后代进行抗性选择。研究结果认为d CAPS标记4451_fon可以作为西瓜抗枯萎病分子辅助选择(molecular marker assisted selection,MAS)的重要工具,能够实现提高选择效率、加速育种进程之目的。     

辣椒疫病抗性位点的分子定位

为鉴定辣椒疫病抗性性状位点(QTL),开发抗病基因相关分子标记,实现辣椒抗疫病分子标记辅助选择育种,本研究以辣椒高抗疫病材料PI201234和高感疫病材料G29为亲本构建的F2群体为试验材料,采用游动孢子灌根法对6~8叶期的F2群体单株进行疫病抗性接种鉴定,同时利用EST-SSR标记对F2群体进行基因型分析。结果显示,构建了包含65个EST-SSR标记、总长度为418.6 c M的辣椒遗传连锁图谱;结合F2群体的疫病抗性鉴定结果,定位了位于N3连锁群EST451与EST191之间的抗病QTL,该QTL可解释表型变异率为14.9%。     

一个高抗玉米南方锈病基因的QTL定位及遗传分析

【目的】通过对一个热带高抗玉米南方锈病材料S313与4个高感玉米南方锈病材料组配的8个F_2群体进行两年三季的遗传分析,在表型鉴定的基础上,利用其中1个F_2群体进行局部遗传图谱构建及抗性基因定位,并利用大群体及新开发的分子标记对抗性主效QTL进行精细定位,为进一步克隆该基因奠定基础。【方法】连续三季对8个F_2分离群体,分3个时期进行病原菌接种,玉米生长后期按1—9级标准等级记载各单株的抗南方锈病级数,进行抗性表型鉴定,最终确定抗、感分离比例。利用56K芯片筛选出2个亲本间多态标记,选择其中均匀分布的192个标记对S313×PHW52的F_2群体中各30个高抗、高感子代进行KASP分型。利用第10染色体短臂上19个SNP标记对整个F_2群体进行分型,构建局部遗传图谱;将遗传图谱与田间抗性表型鉴定结果相结合进行抗性QTL定位。开发初定位区间内10个SNP标记对次级群体进行标记分型,根据交换单株数量大小进一步缩小定位区间。根据玉米B73 Ref Gen_V4参考基因组信息,列出对应定位区间内的所有基因,利用基因的功能注释信息,确定可能与玉米抗南方锈病相关的候选基因。【结果】8个F_2群体田间抗、感分离比均符合3﹕1的分离比例,说明热带自交系S313对玉米南方锈病的抗性是由1个效应比较大的主效QTL控制。利用56K芯片筛选出2个亲本间的多态标记16 426个。利用192个标记对各30个抗、感子代进行连锁分析,获得了1个抗性连锁标记Affx-90241059。利用19个SNP标记构建了总遗传距离为31.8 cM,标记间平均距离1.77 cM的局部遗传图谱。利用复合区间作图法把该主效QTL定位在标记Affx-91298359与标记Affx-91182449之间,区间大小约2 M。进一步利用F_2大群体及10个SNP标记把该区间缩小到474 K的范围内。玉米参考基因组B73的对应区间内共有63个基因,其中3个基因LOC103640657、LOC100191493、LOC103640673编码的蛋白质与植物抗病性有关,因此把这3个基因列为热带玉米种质S313高抗玉米南方锈病的抗性候选基因。【结论】S313对玉米南方锈病的抗性是由1个主效QTL控制,并且S313的主效基因定位在第10染色体短臂约0.47 M的范围内。在该范围内有3个玉米南方锈病抗性候选基因。     

基于CAPS标记的西瓜果实与种子相关性状QTL分析

【目的】基于西瓜全基因组重测序数据,挖掘SNP位点并将其转变为CAPS标记,构建遗传连锁图谱,对西瓜果实与种子相关性状进行QTL分析,为西瓜果实与种子相关性状主效基因精细定位及克隆奠定理论基础。【方法】以普通栽培西瓜品系(Citrullus lanatus ssp.vulgaris)‘W1-1’和黏籽西瓜品系(Citrullus lanatus ssp.mucosospermus)‘PI186490’为亲本杂交获得F_1代,以‘W1-1’为轮回亲本,构建BC_1P_1群体。采摘成熟果实,对每个西瓜果实中心及边缘可溶性固形物、中心及边缘果肉硬度、种子百粒重、种皮底色进行调查及数据分析。对亲本材料进行覆盖度约为20×的全基因组重测序,用BWA、SAMTOOLS及VCFTOOLS等软件比对并检测亲本材料在全基因组范围内的SNP位点。运用SNP2CAPS软件选择7种在西瓜基因组上具有丰富酶切位点的限制性内切酶,对包含SNP位点的序列进行酶切位点分析,转化CAPS标记。选取全基因组范围内均匀分布的450个CAPS分子标记,筛选多态性CAPS标记,对BC_1P_1群体内225株分别进行基因分型,使用QTL Ici Mapping及Windows QTL Cartographer V2.5等软件进行遗传图谱的构建和西瓜果实与种子相关性状的QTL分析。【结果】在两亲本间共获得SNP位点751 532个,根据7种限制性内切酶位点信息共开发了450个CAPS分子标记,筛选出其中具有多态性的200个CAPS标记,在225株BC1P1群体构建一张包含11个连锁群(分别对应11条染色体)的遗传连锁图谱,覆盖长度1 376.95 c M,标记间的平均遗传距离为6.88 c M。QTL分析定位到与果实与种子相关性状QTL位点15个,其中包括中心可溶性固形物含量相关位点3个(CTSS2.1、CTSS2.2、CTSS8.1);边缘可溶性固形物含量相关位点1个(ETSS2.1);中心果实硬度相关位点3个(CFF6.1、CFF6.2、CFF8.1);边缘果实硬度相关位点2个(EFF6.1、EFF6.2);种皮底色相关位点4个(SCC8.1、SCC8.2、SCC8.3、SCC8.4);种子百粒重相关位点2个(SHW6.1、SHW9.1)。15个QTL位点的贡献率范围为5.25%—74.59%,贡献率大于15%的位点有5个(CTSS8.1、SCC8.1、SCC8.2、SCC8.3、SCC8.4)。【结论】共开发出SNP位点751 532个,QTL分析检测到西瓜果实与种子相关性状QTL位点15个,其中主效QTL位点5个,分别为果实中心可溶性固形物及种皮底色相关位点(CTSS8.1、SCC8.1、SCC8.2、SCC8.3、SCC8.4),为进一步精细定位及克隆西瓜果实与种子优良性状基因奠定了基础。     

基于SNP标记的桃矮化基因精细定位

【目的】矮化型桃树体矮小、节间短,是盆栽观赏和砧木育种的重要遗传资源。明确矮化性状形成的遗传机制并对桃矮化基因进行精细定位,是建立目标性状分子辅助选种体系和遗传改良的前提,可为有目标的选育矮化观赏桃和砧木品种奠定基础。【方法】以‘05-2-144’(‘97矮’ב鸳鸯垂枝’桃)套袋自交获得的395个后代单株构建的分离群体为材料。参考桃基因组信息并基于Sanger技术开发的SNP标记对亲本和后代单株进行分析,在扩大群体单株中进行连锁关系分析,确定连锁的SNP标记,初步定位目标基因。在定位区域内基于二代测序技术开发更多的基因型和表型一致的SNP标记,对后代单株进行基因分型,完成目标性状的精细定位。然后在精细定位区域内开发SNP标记,即杂交群体双亲均为Aa杂合基因型,对‘10-7’ב96-5-1’杂交后代89个单株进行分子鉴定,以验证基因定位结果的准确性。【结果】通过对桃单株‘05-2-144’自交后代实生苗表型鉴定表明,普通型和矮化型单株数分别为300株和95株,性状分离比例接近3﹕1(P值为0.67;χ2为0.19),符合孟德尔遗传规律,桃矮化性状受隐性单基因控制。用于分子鉴定的单株来源于‘10-7’(普通型)ב96-5-1’(普通型)杂交组合,共获得89个后代单株,其中普通型66株;矮化型23株(P值为0.854;χ2为0.034)。基于Sanger测序技术开发了SNP标记,在桃基因组数据库Pp06上25 230 425 bp和27 191 090 bp处获得了连锁的SNP标记,且目标基因位于这两个标记的右侧,初步获得了连锁的SNP分子标记。在此基础上,对亲本进行66.89X深度测序,继续开发符合Aa杂合基因型的SNP标记位点。根据参考基因组和物理距离区间共设计了15对SNP引物,其中12对引物与重测序结果中SNP的类型一致,3对引物与重测序结果中SNP的类型不一致,连锁标记的基因分型成功率为80.0%。通过基于SNP基因分型分析,最终完成了目标性状的精细定位,位点位于Pp06的28 712165 bp(引物为JXSNP-5)和28 899 661 bp(引物为JXHRM-SNP-3)之间,遗传距离分别为0.38 c M和0.13 c M,物理距离约为277 kb,精细定位区域内有54个已知转录本。在定位区域内桃基因组Pp06的28 108 436 bp处和29 247 763 bp处开发SNP标记用于杂交后代表型的鉴定,结果表明所有后代单株基因型和表型鉴定结果完全一致,鉴定准确率为100%。【结论】本研究精细定位了桃矮化基因,物理距离约为277 kb,为基因克隆、亲本早期筛选以选育矮化观赏桃和砧木品种等奠定了基础。     

水稻细菌性条斑病抗性基因bls2 SSR分子标记开发

【目的】开发水稻细菌性条斑病（简称细条病）抗性基因bls2 SSR分子标记,为利用分子标记辅助选择培育水稻细条病抗性品种提供技术支撑。【方法】基于本课题组前期对细条病抗性基因bls2初定位结果,设计SL03与SL04分子标记区间的SSR引物,从中筛选出在亲本间具有多态性的引物,用于检测由普通野生稻DY19与籼稻9311为亲本构建的BC₃F₂群体中各单株的基因型,并结合细条病病斑长度测定结果,利用MapQTL 5.0精细定位bls2基因,鉴定出与之紧密连锁的SSR分子标记,并比较单标记或双标记的选择效果。【结果】通过田间细条病抗性鉴定发现,BC₃F₂群体抗、感分离符合理论比1∶3的孟德尔单基因遗传分离规律。利用筛选鉴定出的11个多态性分子标记对BC₃F₂群体共244个单株进行单株基因型检测,并结合单株抗性表型值,将细条病抗性基因bls2精细定位于2号染色体上RM13592和RM13599分子标记之间,物理距离240 kb;RM13592和RM13599分子标记在BC₃F₂群体上的分离比均符合1∶2∶1的单基因遗传分离规律。利用单标记和双标记均可有效选择BC₃F₃群体中的感病单株和抗病单株。RM13592和RM13599分子标记辅助选择符合率分别达92.62%和93.44%,使用双标记的选择符合率为93.44%。【结论】RM13592和RM13599与细条病抗性基因bls2紧密连锁,具有易于PCR扩增,易于识别,准确性高的特点,可作为水稻抗细条病育种上分子标记辅助选择的有效标记。     

基于染色体片段置换系的野生稻粒长QTL——qGL12的精细定位

【目的】利用野生稻染色体片段置换系以及次级群体,精细定位与水稻粒长相关的QTL,发掘野生稻中影响粒长的新基因,为水稻育种提供遗传材料和基因资源。【方法】利用中国农业科学院作物科学研究所野生稻实验室已构建的野生稻染色体片段置换系群体,定位到一个与粒长相关的QTL——qGL12。在此基础上,选择粒长与受体亲本9311差异显著,且携带qGL12片段的置换系CSSL141与9311回交构建次级分离群体,设计区间内分子标记引物,筛选交换单株,结合粒型表型分析与基因型鉴定,对qGL12进行精细定位。通过扫描电子显微镜检测颖壳细胞,观察细胞的长宽变化,对定位区间内的基因进行基因注释以及测序分析,预测候选基因。【结果】根据整套置换系多个环境下的表型鉴定,qGL12初定位于第12染色体标记RM28621附近;选取携带qGL12的置换系CSSL141作为精细定位的亲本,CSSL141携带4个野生稻导入片段,在多年多点的田间试验中,CSSL141粒长、粒宽、粒重均明显高于9311;利用构建的CSSL141/9311 F2群体将qGL12定位于第12染色体标记RM5479与RM28621之间,影响粒长、粒宽以及粒重,对粒长的贡献率最高,为44.61%。在定位区间内设计了7个多态性分子标记引物,选择目标区间基因型杂合的植株种植F3,通过筛选交换单株,结合交换单株的基因型与表型,将qGL12定位于RM5479与RM28586之间50 kb区间内,为进一步缩短定位区间,在此区间内设计了4个多态性分子标记引物,选择交换单株种植下一代,筛选后得到20株交换单株,结合交换单株基因型与籽粒表型,最终将qGL12定位到第12染色体15.69 kb区间,该区间内有3个候选基因,其中Os12g39650编码一种微管蛋白,Os12g39660编码一种质膜钙转运ATP酶,Os12g39670尚未有明确功能,通过测序分析发现,Os12g39650、Os12g39660在编码区内存在变异;对亲本以及后代交换单株的颖壳细胞进行电镜扫描,发现9311颖壳细胞的长度与宽度均比CSSL141小,CSSL141/9311 F4代群体中,目标区间为野生稻基因型的交换单株颖壳细胞的长度与宽度均比目标区间为9311基因型的交换单株大,表明qGL12通过调控颖壳细胞的大小影响水稻粒长。【结论】利用野生稻染色体片段置换系,将野生稻粒长QTL——qGL12定位于第12染色体15.69 kb区间内,通过调控水稻颖壳细胞的大小影响粒长。该区间内有3个基因。来自野生稻的Os12g39650与Os12g39660与栽培稻等位基因相比,存在自然变异,确定为qGL12的候选基因。     

贵州地方辣椒材料疫病抗性鉴定的分子标记引物筛选

为贵州地方辣椒种质资源疫病抗性鉴定及抗疫病辣椒品种的分子标记辅助育种提供参考,以具有代表性的贵州地方辣椒抗疫病纯系母本S016(P_1)、高感疫病纯系父本S010(P_2)和S022(P_3)及其杂交F_1代和F_2代为试验材料,用已报道辣椒疫病抗性鉴定相关分子标记的18对引物为候选标记引物,采用育苗接种鉴定和分子标记鉴定相结合的方法对适合贵州地方辣椒品种资源疫病抗性鉴定的分子标记引物进行筛选。结果表明:在18对候选引物中有16对引物对3个亲本及其F1代材料的DNA扩增条带无特异性,Primer3引物对3个亲本材料的DNA扩增条带无特异性,该17对引物均不适合用于贵州地方辣椒品种资源疫病的抗性鉴定。Primer1引物对S016和S022亲本材料的DNA扩增条带存在特异性,经F_2代群体材料进一步验证,该引物可作为类似S016和S022亲本及其杂交后代材料的疫病抗性鉴定。     

G.41×新疆野苹果树体生长性状的QTL精细定位及候选基因预测

【目的】矮化砧木可以诱导地上部接穗品种矮化,实现苹果的丰产和稳产。因此,深入挖掘调控苹果树体生长的基因,可以改善苹果树形,加强苹果园地的管理方便性。【方法】以矮化苹果砧木‘G.41’和乔化苹果砧木新疆野苹果(Malus sieversii)为亲本构建的188株F1代分离群体为试材,并于每个分离群体植株上嫁接‘富士冠军’。基于SSR标记技术,采用Join Map 4.0作图软件构建苹果遗传连锁图,应用Map QTL 5.0作图软件,结合后代群体的表型数据,对接穗高度和接穗横截面积生长性状进行初步QTL定位。结合苹果基因组序列信息,利用Primer5.0软件进行新SSR标记开发,并对初步定位区域进行精细定位及候选基因预测。【结果】该研究从361对SSR引物中筛选出108对在亲本之间表现出多态的SSR引物,多态率为29.9%。其中95对引物用于遗传连锁图谱构建,并在5号连锁群上初步检测出4个与植株生长性状相关的QTL位点,与接穗高度、接穗横截面积性状紧密连锁的两个标记,为L05024和Hi09b04。根据初步定位区域的序列信息,设计了新的SSR引物24对,其中在亲本间表现出多态的有10对,利用该10对引物对5号连锁群重新分析。构建了包含21个SSR标记、总长为86.0 c M的高密度遗传图谱,其平均遗传距离为7.52 c M。通过对接穗高度与接穗横截面积生长相关性状的QTL分析,在SSR标记L05024和Hi09b04之间找到与其相关的QTL位点,其表型贡献率分别为19.2%和51.7%。将该QTL位点与基因组序列对比,发现其物理距离为543 kb,并且该QTL区间包含16个候选基因。推测其中MDP0000323212为与植株生长密切相关的基因。【结论】本研究将砧木诱导矮化基因定位于苹果第5号染色体543 kb区段内,侧翼标记分别为L05024和Hi09b04,其物理距离为4.048—4.591 Mb,并筛选到可能参与调控植株生长的候选基因MDP0000323212。     

利用大白菜×芜菁F2群体定位抗根肿病QTL及上位性互作分析

【目的】挖掘和分析芸薹种抗根肿病基因及基因间的互作关系,为芸薹种抗根肿病育种提供理论依据。【方法】以大白菜自交系‘BJN’为母本,芜菁自交系‘Siloga’为父本进行杂交获得F₁。F₁单株自交获得由140个单株构成的F₂群体,用于遗传图谱构建。95个F₂单株及其F₃家系用于抗根肿病（CR）性状的QTL定位和上位性互作分析。利用1 214个分子标记和前人开发的与7个CR连锁的22个标记进行亲本间多态性筛选。根据作图群体的多态性标记基因型,采用JoinMap 4.0作图软件构建遗传连锁图谱。以采自甘蓝型油菜栽培地的根肿菌对2个亲本及其95个F_2：3家系进行根肿病抗性鉴定。根据F₃植株的发病等级,计算F₂单株的平均发病指数（DI）。利用Windows QTL Cartographer 2.5软件,采用复合区间作图法检测抗根肿病QTL。利用基于混合线型模型的QTL Network 2.0软件进行互作关系分析。SPSS 18.0.0软件用于分析F₂群体中QTL连锁标记的基因型与其相应个体平均DI值间的相关性。双因素方差分析方法分析QTL连锁标记的交互作用。通过单因素方差分析,采用最小显著差异法和q检验（SNK）多重比较QTL紧密连锁标记（sau_um026和BrID90197)组合成的9种基因型在根肿病抗性上的差异。【结果】抗病性鉴定表明‘Siloga’对根肿菌表现为抗病,而‘BJN’表现为感病。F₂群体中根肿病发病指数呈偏正态分布,表明根肿病抗性表现为由主效基因存在的多基因控制的数量性状。利用检测到的261个多态性标记构建出一个包含222个标记和10条连锁群的芸薹种遗传图谱。该图谱总长度为1 152.6 cM,定位了与3个CR连锁的5个标记,覆盖了大白菜参考基因组的88.6%。通过QTL定位共检测到源于‘Siloga’的2个QTL位点,分别位于A3连锁群的主效QTL（qPbBa3.1）和A8连锁群的微效QTL（qPbBa8.1）。qPbBa3.1和qPbBa8.1的贡献率分别为19.02%和7.82%。qPbBa3.1区域内包含有抗根肿病基因CRa或CRb,而qPbBa8.1与Crr1毗邻。此外,检测到qPbBa3.1和qPbBa8.1间的上位性互作,互作效应为加性×加性,贡献率为6.58%。双因素方差分析表明,sau_um026与BrID90197间存在极显著差异（P=7.22×10^-5）,进一步验证了qPbBa3.1和qPbBa8.1间的互作效应。单因素方差分析表明,sau_um026和BrID90197的9种基因型间存在显著性差异（P=9.45×10^-10）。多重比较结果表明,qPbBa3.1为抗病亲本‘Siloga’基因型的个体抗病性显著高于其他基因型,杂合基因型的高于感病亲本‘BJN’基因型,含有qPbBa8.1的个体抗病性得到加强。【结论】芜菁自交系‘Siloga’根肿病抗性受主效qPbBa3.1,微效qPbBa8.1,qPbBa3.1和qPbBa8.1间的加性×加性上位性互作效应的影响。     

小麦残茬对连作西瓜生长及根际土壤微生物的影响

【目的】土壤微生物群落结构构成是土壤生态环境质量的重要组成部分,探讨两种小麦残茬对连作西瓜生长及根际土壤微生物的影响,阐释西瓜枯萎病与根际土壤微生物间的关系,为西瓜连作障碍和枯萎病的生态防治提供依据。【方法】将D123和D125两种小麦残茬粉碎后施入瓜类连作土壤中并继续栽培西瓜,采用常规方法测定西瓜蔓长、鲜重及产量,稀释平板法测定根际土壤中细菌、真菌和尖孢镰刀菌数量,通过Real-time PCR测定西瓜根际土壤中功能微生物芽孢杆菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌数量。【结果】D123和D125两种小麦残茬的施入,促进了西瓜蔓长的伸长,并在后期显著促进了植株地上鲜重、根鲜重和全株鲜重的增加(P0.05),且D125处理略高于D123处理;残茬处理虽然增加了西瓜单株产量,但与对照(CK)差异不显著。对根际土壤微生物数量统计表明,定植第20天时,D125处理细菌数量显著高于D123处理与CK(P0.05),D123与CK间差异不显著;定植第30天时,D125处理细菌数量显著高于CK(P0.05),D123与CK、D125间差异均不显著。对真菌数量的研究表明,各时期均表现为D125D123CK,并在定植30 d时相互间差异显著(P0.05)。对根际尖孢镰刀菌数量的研究表明,各时期均表现为D125D123CK,在定植30 d时,D125处理显著高于D123处理和CK(P0.05),但D123处理和CK间差异不显著。土壤中细菌/真菌的比值随着取样时期的延长,呈下降趋势,细菌繁殖速度低于真菌繁殖速度;定植20 d时,D125处理的根际土壤中细菌/真菌的值显著高于D123处理和CK(P0.05),D123处理与CK间差异不显著。随着西瓜植株的生长,土壤中西瓜专化型尖孢镰刀菌的数量呈增长趋势,各时期尖孢镰刀菌均表现为CKD123D125,在定植第20天和第40天时表现为小麦残茬处理显著降低了尖孢镰刀菌数量(P0.05)。芽孢杆菌数据表明,各处理在定植30 d时芽孢杆菌数量均达到最高,其他时期均较低,小麦残茬的施入增加了根际土壤中芽孢杆菌数量,D125处理在各时期均表现为显著高于CK(P0.05),D123处理在定植后20 d和30 d表现为显著高于对照(P0.05),而D125处理在定植后20 d和40 d显著高于D123处理(P0.05),定植后30 d时则表现为相反的结果。【结论】小麦残茬的施入,促进了西瓜生长,有利于土壤微生物繁殖,并增加有益微生物数量,减少枯萎病致病菌数量,对西瓜连作土壤有一定的修复作用。     

水稻开颖半不育突变体的观察、遗传分析和基因定位

【目的】通过对一份航天诱变水稻(Oryza sativa L.)开颖半不育突变体ohss(open-hull semi-sterility)进行形态特性调查、遗传分析和基因定位,筛选候选基因,为下一步基因克隆和功能分析奠定基础。【方法】以籼稻品种航恢七号为材料,通过"神舟八号"飞船搭载,诱变获得一份水稻开颖半不育突变体ohss。对其进行形态特征解剖观察,分析颖花器官发育突变特点。调查突变体和野生型的花粉可育率、自然结实率和套袋自交结实率,对其育性进行鉴定。随机选取5个成熟单株,考察穗部谷粒相关性状并进行统计分析。通过覆盖全基因组的SSR分子标记检测,解析空间诱变的分子变异效应。以航恢七号、Francis和02428与突变体ohss配制杂交组合,观察F1和F2植株的花器官表型,进行χ~2测验,对突变性状进行遗传分析。以02428/ohss的F_2分离群体作为目标基因定位群体,同时利用SSR标记以及新开发的多个In Del分子标记开展基因定位研究。利用RAP水稻基因组注释数据库对定位区间的候选基因进行预测,通过序列比对和基因表达分析筛选候选基因。【结果】开颖半不育花器官突变体ohss与野生型相比,抽穗期穗部明显包茎,颖花发育出现异常,内外稃片瘪弱、扭曲变形且开裂不抱合,颖花内部发育类似内稃状的器官,部分颖花没有内稃的分化。ohss发育异常颖花中可育花粉率58.74%,导致单株结实率、穗重、穗实粒数与野生型相比极显著降低。全基因组SSR标记检测表明突变体ohss总变异频率为0.0336,除了第7、12染色体未检测到突变位点,其他染色体上检测到突变频率范围为0.0143—0.0889。遗传分析结果显示ohss的开颖半不育表型受单隐性核基因ohss(t)控制,并将ohss(t)定位在水稻第3染色体上2个In Del标记In Del6043和In Del6070之间约27.6 kb的物理距离内。该区域有3个预测注释基因,序列比对和表达分析表明突变体ohss的Os MADS1编码区及启动子序列未发生突变,但是表达模式发生强烈改变。【结论】开颖半不育的花器官发育突变体ohss受单隐性核基因ohss(t)控制,ohss(t)定位在水稻第3染色体上In Del6043和In Del6070标记之间约27.6 kb的物理距离内,其Os MADS1的编码序列及5′UTR区未发生碱基突变但表达受到强烈抑制。     

西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达分析

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因CIMYB转录因子,进行生物信息学及表达模式分析,为进一步解析CIMYB在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和Microarray数据分析,获得与西瓜抗枯萎病相关的基因CIMYB,采用RT-PCR技术分离克隆CIMYB c DNA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征;使用MEGA5.0对CIMYB蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;采用GFP标记的方法进行亚细胞定位,分析编码蛋白表达位置;将该基因片段通过Nde I和Xba I双酶切连接至原核表达载体p Czn1,重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express,经终浓度为0.5 mmol·L~(-1) IPTG诱导4 h,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸(jasmonate,JA)诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从西瓜野生材料PI296341-FR根系组织中克隆该基因片段(Gen Bank:KT751229),序列比对及生物信息学分析表明,其基因编码的氨基酸序列具有MYB转录因子R2R3型的典型特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,C端高度变异。多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与甜瓜MYB(Gen Bank:XM_008440304)和黄瓜MYB(Gen Bank:XM_011652633)同源性最高,其编码的氨基酸一致性达到86%,这与它们同属葫芦科植物有关;亚细胞定位显示CIMYB定位于细胞核,为典型的转录因子;成功构建了该基因的原核表达载体p Czn1-CIMYB,转化至大肠杆菌得到36 k D左右蛋白;CIMYB受枯萎病菌诱导,在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中,相对感病品种表达量高峰出现的早,且表达量高。50μmol·L~(-1)的Me JA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平,同时诱导CIMYB表达,与抗病材料PI296341-FR相比表达趋势一致,但表达量更高。【结论】CIMYB为典型的R2R3-MYB转录因子,亚细胞定位于细胞核中;基因的原核表达得到36 k D的融合蛋白,在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸诱导,推测CIMYB可能参与JA介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路,在西瓜抗病中起一定的作用。     

小麦-长穗偃麦草7E抗赤霉病易位系培育

【目的】将二倍体长穗偃麦草7E染色体导入主栽小麦背景,培育小麦-长穗偃麦草7E染色体抗赤霉病易位系,为小麦抗赤霉病遗传改良利用外源优良基因提供新种质。【方法】利用中国春-长穗偃麦草7E代换系DS7E(7B)与扬麦16杂交的F_2种子进行~(60)Co辐射(30 000 rad)和种植,表现型选择收获存活M_1植株的种子,从M_2连续通过表型农艺性状选择、单花滴注法进行赤霉病抗性鉴定和长穗偃麦草7E染色体或染色体臂特异分子标记PCR扩增筛选,最后在M_4代对中选材料以长穗偃麦草基因组DNA为探针进行基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)证实。【结果】M_1选择了赤霉病发病率不同的13个单株进行繁殖。利用前期开发的长穗偃麦草7E染色体和7EL、7ES特异标记检测13株的后代M_2单株,获得含有长穗偃麦草7EL片段7株和7ES片段14株;对21株M_2衍生的222个M_3植株进行特异标记检测,共选择含有长穗偃麦草7EL片段13株和7ES片段3株;利用来自12株M_3的后代(M_4)进行GISH,共9株M_3的后代具有小麦-长穗偃麦草易位染色体,体细胞染色体2n=42。2株M_3的后代显示附加2条长穗偃麦草染色体短臂,体细胞染色体2n=44。连续多年多途径的筛选,获得4份材料,3份材料均为长穗偃麦草7E染色体长臂易位系,命名为TW-7EL1、TW-7EL2和TW-7EL3。1份为7E染色体短臂附加系,命名为W-DA7ES,最后所获得的材料是源自M_1代2个单株。连续3年赤霉病抗性鉴定结果表明长穗偃麦草7EL易位系抗性高,发病率明显低于中国春和扬麦16,与苏麦3号相当,而7ES附加系的赤霉病抗性明显较低,发病率明显高于7EL易位系。【结论】通过赤霉病抗性鉴定、染色体特异分子标记筛选和GISH证实相结合培育了小麦-长穗偃麦草7EL抗赤霉病易位系,长穗偃麦草易位片段鉴定快速和准确。二倍体长穗偃麦草7E染色体长臂中含有抗小麦赤霉病的基因。     

油菜株高QTL定位、整合和候选基因鉴定

【目的】通过对油菜株高进行多环境QTL定位并与已报道的油菜株高QTL和植物株高基因分别进行整合和比对分析,揭示油菜株高的遗传结构和候选基因并为其分子改良提供依据。【方法】以油菜优良品种中双11(测序)和No.73290(重测序)衍生的含184个单株的Bna ZNF2群体为试验材料。首先,对Bna ZNF2群体进行基因型分析,利用Joinmap 4.0软件构建了一张含803个分子标记的高密度遗传图谱。其次,对F2:3和F2:4家系进行连续两年(2010—2011)两点(武汉和西宁)田间试验和表型鉴定。然后,利用Bna ZNF2群体的基因型数据和F2:3以及F2:4家系的株高表型数据,采用Win QTLCart 2.5软件的复合区间作图法进行QTL检测。最后,利用元分析的方法采用Bio Mercator软件对不同环境中检测到的株高QTL进行整合。【结果】对两年两点环境下分别检测到的株高QTL进行整合总共得到5个株高QTL的位点:q PH.A2-1、q PH.A2-2、q PH.C2-1、q PH.C3-1和q PH.C3-2,分布于A2、C2和C3染色体上,解释2.6%—55.6%的表型方差。其中,q PH.A2-1和q PH.A2-2只在武汉检测到,而q PH.C2-1、q PH.C3-1和q PH.C3-2只在西宁检测到。位于C2连锁群的主效QTL-q PH.C2-1只在西宁被重复检测到,而且LOD值、加性效应和贡献率(分别为23.4、-16.0和55.6%)均高于前人报道,是目前发现的效应最大的一个油菜株高QTL。基于油菜基因组物理图谱对本研究和已报道的油菜株高QTL和植物株高基因分别进行整合和比对分析,获得了一个由183个QTL和287个候选基因组成的相对完整的油菜株高遗传结构图。其中,有18个株高QTL簇能在不同研究中被共同检测到,分布在A1、A2、A3、A6、A7、A9、C6和C7染色体上。另外,本研究定位到的5个油菜株高QTL的物理位置和已报道的油菜株高QTL均不重叠,因而是新的株高QTL位点。其中,q PH.A2-2、q PH.C3-1和q PH.C3-2物理区间内总共找到了15个株高同源基因,而11个在2个亲本中存在序列变异,被选作候选基因进行进一步研究。【结论】QTL定位和整合获得5个油菜株高QTL,均为首次报道而且都只在武汉或西宁被检测到。其中位于C2连锁群的主效QTL效应值超过以往报道,表现出极强的QTL与环境的互作。通过与已报道的油菜株高QTL和植物株高基因分别进行整合和比对分析,较为全面地揭示了油菜株高的遗传结构和候选基因,生物信息学分析还鉴定到11个位于本研究定位到的3个株高QTL区间内的候选基因。     

西瓜枯萎病抗性及其嫁接对根际土壤微生物数量及群落结构的影响

 【目的】揭示不同枯萎病抗性西瓜品种根际土壤微生物的差异及嫁接提高抗病性的土壤微生物学基础。【方法】以抗枯萎病西瓜品种‘甜妞’和感枯萎病西瓜品种‘天使’为试材，以南瓜（博强1号）为嫁接砧木，采用平板计数及PCR-DGGE技术，研究抗感枯萎病西瓜品种自根苗、嫁接苗和砧木不同生育期根际土壤微生物数量及群落结构的变化。【结果】抗性品种根际土壤细菌数量在生育期的中后期显著高于感病品种，根际土壤真菌数量显著低于感病品种；感病品种嫁接后根际土壤细菌和放线菌数量均高于非嫁接处理，而镰孢菌除苗期外均低于非嫁接处理；PCR-DGGE结果表明，不同处理根际土壤细菌、真菌群落结构存在差异，且随生育期的变化而变化。对差异条带测序分析说明不同西瓜品种及嫁接砧木南瓜根际分布不同的细菌和真菌群。【结论】西瓜抗病品种的根际土壤细菌和放线菌的数量显著高于感病品种，而真菌和镰孢菌数量显著低于感病品种，品种的抗性与根际土壤微生物的种群和数量密切相关；嫁接提高了感病品种根际土壤细菌、放线菌微生物数量，抑制了枯萎病菌的积聚，改变了根际土壤微生物群落结构。植物基因型对根际土壤微生物群落结构有显著影响，而根际微生物群落结构的不同将导致植物对病原菌的抗性差异及品种差异。     

基于BSA-Seq技术的甜瓜抗霜霉病InDel标记开发

目的 获得与甜瓜抗霜霉病基因连锁的分子标记或功能标记,用于甜瓜分子标记辅助选择育种。为进一步克隆甜瓜抗霜霉病主效基因奠定基础。方法 以野生高抗霜霉病资源DM-4和感病自交系DM-2为亲本,构建F₂代分离群体,利用BSA-seq对甜瓜抗霜霉基因进行QTL定位,开发InDel分子标记,并在双亲及其F₂群体单株进行筛选验证。结果 甜瓜抗霜霉病主效QTL位于第9号染色体。在候选区间开发了37个InDel分子标记,有9个PCR产物大小在抗、感双亲表现出差异,用F₂单株验证,结合田间表型鉴定结果,引物InDel 15和InDel 20准确率分别为95 %和98 %,引物InDel 15和InDel 20在抗病亲本中扩增产物大小分别为251和349 bp,在感病亲本中分别为231和324 bp。结论 引物InDel 15和InDel 20可以作为分子标记进行抗霜霉病辅助选育,加快了甜瓜抗霜霉病育种速度。     

尖镰孢EST-SSR信息分析及分子标记建立

【目的】探讨尖镰孢（Fusarium oxysporum）表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列中简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点的分布特点,开发尖镰孢EST-SSR引物,为镰孢菌遗传多样性分析提供技术支持。【方法】从NCBI公共数据库下载尖镰孢EST 9 304条,利用SSRIT软件查找SSR位点,Primer Premier 5.0软件设计EST-SSR引物,用非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分离SSR-PCR扩增产物,并选用能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的引物,对23株尖镰孢菌株进行SSR遗传多样性分析。【结果】在尖镰孢EST序列中,共搜索到92个SSR位点,分布于90条EST序列中,出现频率为1.0%。其中二核苷酸重复类型是最主要的SSR类型,占总SSR的比例为59.78%。其次为三核苷酸与五核苷酸重复类型,占总SSR的比例分别为17.39%、11.96%。出现频率最高的基序是（AC/GT）（0.51%）。设计合成的30对引物中有20对（66.7%）能够有效扩增,其中14对引物（46.7%）能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的产物。尖镰孢的遗传多样性分析结果表明,利用筛选出的14对引物扩增出62条条带,其中多态性条带59条,多态性位点比例为95.2%,平均每对引物可扩增4.2条。供试菌株间的遗传相似系数为0.487—0.933,平均为0.686。供试菌株间存在明显的遗传分化。聚类分析结果表明,当遗传相似系数为0.781时,除14号菌株外,所有菌株均根据寄主来源划分为不同的SSR类群。【结论】基于尖镰孢EST序列开发SSR标记是一种简便有效的方法,研究开发的14对引物可用于尖镰孢的遗传多样性分析。