对不同表达系统的猪圆环病毒2型Rep蛋白的电泳特性分析

利用特异性引物从圆环病毒2型(PCV2)毒株克隆出Rep基因,并将其插入到原核表达载体pET28 a和杆状病毒转移载体pFastbacHT(B)上,利用大肠杆菌BL21(DE3)株原核系统以及Bac-to-Bac杆状病毒系统表达Rep蛋白.Western-blotting表明,原核和真核表达系统均能表达出圆环病毒2型Rep蛋白,电泳分析表明,不同系统表达得到的Rep蛋白有不同的电泳特性,揭示Rep蛋白存在翻译后修饰.     

eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣.为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pFGC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR.注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达.     

3种不同启动子构建ACC脱氨酶基因植物表达载体

从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)UW4菌株克隆出ACC脱氨酶(1-aminocyclopmpane-1-carboxylic acid deaminase)基因连接至pGEM-T vector上,并采用3种不同启动子(组成型表达启动子CaMV35S、花特异表达启动子CHSA及衰老特异表达启动子SAG12)分别构建ACC脱氨酶基因的植物表达载体,经PCR及酶切鉴定均已构建成功.为后期选择不同的花卉等植物材料遗传转化研究打下基础.     

玉米ZmAATP基因的克隆及遗传转化载体的构建

ATP-ADP转运蛋白(AATP)是质体内外能量供应和物质交换的重要载体,可以通过调节质体内外ATP浓度来影响质体内的合成代谢。本研究克隆了玉米ZmAATP基因,进化树分析显示ZmAATP蛋白与ATPase亲缘关系较近。进一步研发发现,授粉后随着玉米籽粒的发育和淀粉的积累,ZmAATP基因的表达量逐渐提高。另外,我们分别构建了由组成型启动子(Ubi)和胚乳特异型启动子(GluAI)驱动的ZmAATP基因的过量表达载体,为进一步研究该基因在玉米中的生物学功能奠定了基础。     

影响猪生长激素基因工程菌表达效率的因素研究

在摇瓶条件下研究了影响猪生长激素(pGH)基因工程菌表达效率的某些因素。实验结果表明:工程菌 pJW301/JA221在不同光密度时开始诱导,诱导不同时间及不同通气量对pGH 的表达效率影响较大;过夜培养物存放时间的长短及不同氨苄青霉素(Amp)浓度对表达效率稍有影响。表达载体 pJW301转化不同受体菌,其表达效率有较大差异。     

水稻基因差异表达与杂种优势的关系分析

【目的】分析水稻强、弱优势组合的基因差异表达模式特征,探讨其与杂种优势之间的关系。【方法】以扬稻6号、明恢63、特青配置的9个杂种F1为材料,利用差异显示PCR技术(differential display polymerase chain reaction,DD-PCR)分别分析分蘖期(叶片)、孕穗期(幼穗)、抽穗期(剑叶)的基因差异表达模式。【结果】同一时期内强优势组G1(父本扬稻6号)、中优势组G3(父本特青)以及弱优势组G2(父本明恢63)在母本特异表达(UNP1)、父本特异表达(UNP2)、F1特异表达(UNF1)、F1特异缺失表达(ABF1)4个基因差异表达模式上存在明显差异;相关分析表明分蘖期叶片UNP2与单株产量呈极显著正相关,来自父本的基因特异表达有利于提高杂种优势;同一优势组在不同时期的表达模式也存在明显差异,反映了基因的时空表达特征;获得19个G1、G2间特异性差异表达的基因片段,分布在除第12染色体以外的其余11条染色体上,主要涉及物质合成与运输、能量代谢、糖类代谢等重要途径。【结论】水稻强、弱优势组合F1在不同生育期基因表达模式存在显著差异,表型性状的差异可以从基因表达模式上得以反映。     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。     

犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

【目的】为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性。【方法】在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Western-blot检测重组蛋白的生物活性。【结果】大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25 h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67 mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合。【结论】在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础。     

卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

利用反转录PCR (RT-PCR)技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因,连接到pET-28b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达.结果表明,原核表达栽体pET-28b-TNF-α构建成功,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,优化的诱导表达条件为诱导温度37℃、诱导时间4h、IPTG浓度1.0 mmol/L.     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨So NCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据。【方法】以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆So NCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析So NCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况。【结果】克隆获得的So NCED基因(Gen Bank登录号JQ314108),c DNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸。多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,So NCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%。成功构建So NCED基因的原核表达载体p ET-So NCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 k D的蛋白,确定该蛋白为So NCED基因的表达蛋白。q RT-PCR结果分析表明,So NCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6 h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12 h时达峰值。【结论】成功克隆获得甘蔗So NCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程。