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相似文献
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1.
【目的】筛选1株适合PCV2病毒生产的悬浮细胞株,摸索PCV2悬浮生产工艺(病毒种毒来源、MOI及收获时间),为大规模悬浮培养技术制备疫苗提供试验依据。【方法】使用有限稀释法对PK15原细胞稀释后接种于96孔板,每2 d观察细胞生长和形态,待细胞90%长满后,将细胞从96孔板陆续扩至24孔板、12孔板、6孔板,最后到方瓶,筛选3株可贴壁生长的、形态较好的PK15克隆。3株克隆(PK15-1C8、2F11、1E5)按照1×106细胞/mL的密度,直接接种在PK15的无血清培养基中,并置于37℃,5%二氧化碳,120 r/min的摇床培养箱中继续培养,每天监测细胞密度和活率,每3 d传代,使细胞逐渐适应悬浮环境,驯化为可全悬浮、无血清培养的悬浮细胞株;细胞传代稳定并建库后,接种PCV2病毒,通过对比3株悬浮克隆细胞培养PCV2病毒含量的差异,筛选1株克隆细胞,用于生产PCV2;针对不同种毒(来源于贴壁细胞或悬浮细胞),摸索感染MOI(0.1、0.2、0.5)及收获时间(48、72、96、120h),确定PCV2最佳生产工艺。【结果】(1)贴壁细胞置于无血清培养基中,适应至第2代时细胞即可呈悬浮生长,连续传至11代,细胞生长稳定,按照1×106/mL接种细胞,细胞生长72h时细胞密度可达到10×106/mL,活率在95%以上,倍增时间为20h左右;(2)3株悬浮细胞使用相同条件,分别接种PCV2病毒后,PK15-1C8克隆细胞的病毒含量可达到106.4TCID50/mL,克隆PK15-2F11(105.5TCID50/mL)、PK15-1E5(105.6TCID50/mL),3株克隆细胞病毒含量均高于原克隆(104.7TCID50/mL),但PK15-1C8克隆细胞的病毒含量更高且更稳定,确定为后续研究用细胞;(3)使用贴壁细胞来源的种毒(106.4TCID50/mL)感染PK15-1C8克隆细胞后,最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.1MOI接毒,接毒后72h收获,最高病毒含量为106.5TCID50/mL。以来源于悬浮细胞的种毒(106.3TCID50/mL)感染细胞后,病毒含量较贴壁细胞来源种毒更高,最高可达107.3TCID50/mL,其最优工艺为接毒时细胞密度1×106/mL,以0.2MOI接毒,接毒后72h收获。【结论】通过对PK15细胞进行单克隆筛选,驯化悬浮、3株悬浮细胞接种PCV2后病毒含量的对比,确定一株病毒含量最高的悬浮细胞,并以此悬浮细胞为基础进行PCV2生产工艺摸索,建立了全悬浮无血清培养的PK15-1C8细胞增殖PCV2工艺,该工艺首次使用悬浮细胞扩增PCV2病毒为种毒进行接毒,最高病毒含量可达107.3TCID50/mL,可用于工厂化疫苗生产。  相似文献   

2.
为了解湖南省伪狂犬病毒(PRV)病原特征及遗传变异情况,从湖南娄底某猪场采集疑似感染伪狂犬病(PR)病料,通过细胞传代、PCR鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)等进行病毒分离鉴定;对该毒株的gC、TK和gE基因进行PCR扩增及测序,分析其变异情况。结果表明,临床病料接种PK15细胞后有1份样品出现细胞病变,经过PCR和IFA鉴定结果表明分离的毒株为PRV(命名为HuN-LD株),盲传第6代病毒的滴度为107.5 TCID50/mL。与参考PRV毒株相比,该毒株gE、TK和gC基因序列与国内流行变异株对应序列同源性最高,与其他毒株同源性相对较低。基于gC基因序列构建的系统进化数分析结果表明,该毒株与国内2011年后流行变异株亲缘关系最近,属于同一分支,但与国外流行的毒株(NIA3和Becker等)相隔较远,属于不同分支。提示成功分离得到1株PRV变异株,该结果可为湖南省PRV流行病学研究及疫苗研发等提供科学依据。  相似文献   

3.
猪伪狂犬病毒(PRV)的流行对中国养猪业造成巨大损失,而2011年后许多已免疫PRV疫苗的猪场频繁出现gE抗体转为阳性现象,感染猪出现PRV的临床症状,并出现所谓的“流产风暴”,学者们怀疑PRV的重新流行与病毒毒力增强和基因变异有关。为了解PRV变异情况,从各地疑似PRV阳性病料中,通过PK-15细胞分离出4个毒株,对毒株传代培养,进行TCID50与LD50测定,对主要毒力基因gBgCgETK进行扩增测序后分析,确定该4株病毒为PRV株,分别命名为FJ01株、FJ03株、YK株和MS2018株,滴度分别为10-6.63、10-7.08、10-8.10、10-7.18 TCID50s·0.1mL-1,对Balb/c小鼠的LD50分别为102.17、102.72、103.44、103.51 TCID50s,可见FJ01株的毒力最强。对4个毒株的毒力基因与其他PRV毒株进行同源性比对并建立进化树,FJ01株、FJ03株、MS2018株与中国近几年流行的变异毒株如HNX株、HNB株、JS-2012株等在一个大进化分支上,亲缘性较近,而与疫苗株Bartha-K61、SA215等,国际经典毒株Becker、Kaplan等亲缘性较远,变异较大。YK株与国际毒株亲缘性更近,其原因有待进一步探索。  相似文献   

4.
为了解多年生黑麦草对Pb、Zn、Cd的耐性和土壤重金属污染的修复潜力,采用砂培法研究铅(Pb)、锌(Zn)、镉(Cd)对多年生黑麦草生长发育及生理生化特性的影响。Pb2+设0 (CK)、500 (Pb500)、1 000 (Pb1 000)、2 000 mg·kg-1 (Pb2 000)四个处理,Zn2+设0 (CK)、500 (Zn500)、1 000 (Zn1 000)、2 000 mg·kg-1 (Zn2 000)四个处理,Cd 2+设0 (CK)、10 (Cd10)、20 (Cd20)、50 mg·kg-1 (Cd50)四个处理,测定不同浓度Pb 2+ 、Zn 2+ 、Cd 2+胁迫下多年生黑麦草的形态特征、叶绿素含量、抗氧化酶活性、膜脂过氧化产物含量、渗透调节物质含量,利用Fuzzy隶属函数法对这些指标进行综合评价。结果表明:①Pb 2+ 、Zn 2+ 、Cd 2+胁迫显著抑制多年生黑麦草的生长,Pb2 000、Zn2 000和Cd50三个处理对黑麦草的生物量、分蘖及根系生长的抑制作用最显著。②Pb 2+ 、Zn 2+ 、Cd 2+胁迫时,多年生黑麦草会通过增加植物的渗透调节物质和抗氧化酶活性减缓对植物的伤害。超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均随着Pb 2+ 、Zn 2+ 、Cd 2+胁迫浓度的增加呈现先增加后减少趋势;丙二醛和脯氨酸含量随着重金属浓度增加而增加;Pb500和Cd10处理的可溶性糖含量下降,而Zn500处理的可溶性糖含量增加。(3)多年生黑麦草对Pb 2+ 、Zn 2+ 、Cd 2+胁迫有一定的耐受性,不同处理的植株抗逆性由强到弱依次表现为:Zn500 > CK >Zn1 000> Cd10> Pb500 >Zn2 000> Cd20 >Pb1 000 >Pb2 000> Cd50。研究结果为生态恢复提供理论支撑和数据支持。  相似文献   

5.
利用静水法研究了不同饵料密度梯度(0.5×105、1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105个/mL)和不同盐度梯度(27、30、33、36、39)对壳长为60.40(±2.06)mm的长肋日月贝滤水率的影响。结果表明,饵料密度和盐度对长肋日月贝的滤水率有显著影响。以亚心型扁藻为饵料,在适宜的饵料密度范围内长肋日月贝的滤水率随着饵料密度的增加而增大,但当扁藻浓度达到1.0×105个/mL时,滤水率(FRQ)与饵料密度(Q)间呈负相关,其拟合方程为FRQ=2.288Q-0.71(R2=0.987),滤水率开始迅速下降。长肋日月贝的滤水率(FRs)开始随着盐度的升高而升高,在27~33之间存在最大值,然后随盐度的升高而下降,以个体数量计,与盐度(S)间的相关关系为FRs=-0.0110S2+0.7204S-11.2741(R2=0.8913);如以单位体重计算,则可表示为FRs’=-0.0122S2+0.7881S-12.213(R2=0.885);通过公式推算盐度为32.7时,滤水率达到最大、为0.521 L/h·ind。  相似文献   

6.
为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID50)、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRV σC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID50为1×10-7.90·(0.1mL)-1。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。  相似文献   

7.
为了探寻对松果梢斑螟有高致病性的病原微生物,本研究分离培养了采自秦皇岛北戴河区的感染松果梢斑螟幼虫病原物,结合菌种形态特征及 ITS 序列分析鉴定明确了其主要致病菌种,测定了其致病力。结果表明,该菌株为球孢白僵菌(编号 Gq-Bb 菌株),当孢子悬浮液浓度从 1×104孢子 /mL 逐步提高到 1×108 孢子 /mL时,其对各虫龄松果梢斑螟幼虫的致病性逐渐增强。当浓度为 1×108孢子 /mL 时,其 1 龄和 2 龄幼虫的累计校正死亡率均达到 100%,3 龄、4 龄和 5 龄幼虫的分别为 96%、90% 和 77.33%。1 ~ 5 龄幼虫的 LC50值分别为1.26×103、1.90×103、2.99×103、2.12×104、2.12×105孢子/m L,LT50分别为4.34~2.57、4.91~2.78、5.19~2.78、5.73 ~ 2.99和 6.44 ~ 3.64 d,...  相似文献   

8.
为了解变异后伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的致病性,采用细胞培养技术从病料中分离PRV,通过PCR方法对PRV相关基因进行扩增,对毒株进行特异性试验和病毒滴度的测定,并通过动物试验对PRV的致病性进行了研究。结果表明:通过PCR可扩增出大小与预期相符的PRV g G基因片段、g E基因片段以及TK基因片段;病毒毒价可达108.0TCID50∕m L;接种105.0TCID50∕m L病毒后,家兔于52 h左右全部死亡,小鼠于72 h左右全部死亡,104.0TCID50∕m L病毒可致28日龄仔猪死亡或发病。本研究可为预防PRV疫病的流行提供防控依据。  相似文献   

9.
为研究犬细小病毒的生物学特性和遗传进化情况,从湖北馨爱宠物医院有限公司收集疑似病犬的粪便,无菌处理病料后接种猫肾细胞(CRFK)进行病毒的培养,至出现明显的细胞病变。通过PCR扩增、电镜形态学观察、间接免疫荧光检测、血凝试验等进行病毒鉴定,结果表明,成功分离出一株犬细小病毒,并命名为CPV-JZ2021。该病毒的血凝效价为29,TCID50为103.4/0.1 mL。全基因组测序结果表明,该病毒全基因组序列长4 567 bp。构建的系统发育树表明,该病毒与四川、河南、广东和北京等地毒株亲缘关系较近,处于同一进化分支。其中与河南株CPV-HN1587的同源性达99.2%。通过对VP2基因推断的氨基酸序列进行分析,确定该犬细小病毒属于New CPV-2a型。相比较国外已经报道的New CPV-2a型毒株,CPV-JZ2021存在多个关键氨基酸变异。该研究为犬细小病毒的流行情况及新疫苗的开发提供了参考依据。  相似文献   

10.
【目的】大豆高隆象(Ergania doriae yunnanus)是我国南方大豆田间主要害虫之一。本研究旨在明确一株高隆象自然致病真菌的种类及其生物学特性,并测定该菌株对大豆高隆象成虫的毒力,为大豆高隆象的生物防治提供新材料。【方法】对采集的真菌进行分离、纯化培养,形态学观察;提取真菌DNA进而扩增rDNA-ITS,利用BLAST比对和系统进化树构建,鉴定田间致高隆象自然死亡的真菌种类;设置不同培养温度,通过十字交叉法和血球计数板方法测量计算真菌生长速率和产孢量;配置不同浓度的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BEdy1孢子悬浮液,采用浸虫处理法测定对大豆高隆象的毒力,与商品化球孢白僵菌产品LH毒力进行对比;大豆叶片喷施BEdy1孢子悬浮液,评价高隆象取食后的致死效果。【结果】致使高隆象田间自然发病死亡的真菌为球孢白僵菌,菌株命名为BEdy1。该菌株在22—28℃有较高的生长速率,26℃下生长速率最高,达4.34 mm·d-1;在20—26℃有较高的产孢量,22℃下产孢量最大,为4.63×106孢子/mm2。浓度为1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108孢子/mL的BEdy1孢子悬浮液处理高隆象成虫10 d,死亡率分别为49.33%、77.33%、88.67%和98.00%,对照死亡率仅为10%。1×108孢子/mL孢子悬浮液处理下,LT50为(6.79±0.13)d,僵虫率为74.67%,发病严重度最高。10 d的LC50和LC95分别为4.80×104和3.57×107孢子/mL。浓度为1×108孢子/mL的商品化球孢白僵菌产品LH处理高隆象成虫,10 d死亡率为58.00%,僵虫率为4.67%,极显著低于同浓度的BEdy1处理。大豆叶片喷施BEdy1孢子悬浮液后喂食高隆象,10 d死亡率为100%,僵虫率为63.33%,LT50为(5.27±0.35)d。【结论】适当环境条件下,球孢白僵菌菌株BEdy1生长速度快,产孢量高,对大豆高隆象成虫有很高的致死率,具有较大的开发应用潜力。  相似文献   

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