玉米C_4型PPDK基因的分段PCR克隆及其表达载体构建

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4植物和景天科酸代谢(CAM)植物光合作用的关键酶,催化形成固定CO2的初始分子受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。玉米的C4型PPDK基因序列较长,难以直接克隆。本研究设计多对引物,首先利用常规PCR扩增PPDK启动子,再利用分段PCR扩增PPDK基因全长编码序列;测序证实克隆序列正确无误,最后利用In-Fusion技术将各个片段定向克隆至载体p CAMBIA-1391Z,成功构建了玉米C4型PPDK基因的植物表达载体。最终为C4型PPDK基因功能研究和C3植物遗传转化提供可用的基因序列,为全长基因的高效克隆及表达载体构建提供参考。     

转PEPC+PPDK双基因水稻的光合特性

 【目的】系统研究ATP处理后转PEPC+PPDK双基因水稻的光合特性,证明ATP是增强转C4基因水稻光合能力的关键因子。【方法】以原种和转PEPC+PPDK双基因水稻为材料，进行了PCR检测，C4光合酶活性的测定。通过ATP处理后，分析了光、温—光合曲线和活性氧代谢有关指标，统计分析了相关的产量构成因素。【结果】原种中虽有全套的C4光合酶，但活性很低。PCR检测出玉米的PEPC和PPDK基因转入普通水稻后，转PEPC+PPDK双基因水稻高表达了C4光合酶活性。在高光和高温条件下，同未施ATP的相比, ATP处理后转PEPC+PPDK双基因水稻光合速率分别提高17%和12%。在光氧化条件下，耐光氧化能力进一步增强，产量提高15%。【结论】ATP处理后,转PEPC+PPDK双基因水稻增强了光合生产力,表明ATP是设计类似C4水稻的关键因子。     

玉米自交系B73丙酮酸磷酸双激酶基因的克隆及低氮对PPDK表达的影响

以玉米B73自交系为实验材料,克隆了玉米B73叶片C4型丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因即C4PPDK基因的c DNA全长并测序,研究了低氮胁迫对典型C4作物玉米PPDK蛋白表达的影响。结果表明,B73玉米C4PPDK基因有19个外显子,18个内含子。无论在高氮还是低氮条件下,玉米野生型与ppdk突变杂合子在表型上均无显著差异。野生型植株中PPDK表达量约为杂合子的2倍;与高氮处理相比,低氮处理下PPDK野生型和杂合子中PPDK蛋白表达量显著升高,表明PPDK蛋白可能参与了对低氮胁迫的响应。该实验为进一步研究PPDK与氮代谢的关系奠定了基础。     

C4转基因水稻秧苗叶片气孔与叶鞘维管束结构特征

【目的】探明C4转基因水稻高光效的生物学结构基础。【方法】以已导入玉米C4光合关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)和PEPC + PPDK的转基因水稻为材料，以其受体品种Kitaake (WT) 为对照，运用扫描电镜观察了秧苗叶片气孔与叶鞘维管束结构，运用透射电镜观察叶肉细胞。【结果】与对照品种相比，转C4单基因水稻叶片气孔密度提高、面积增大，PPDK气孔密度和气孔面积都居各转基因品系之首；转C4双聚合基因（PEPC + PPDK）水稻叶片气孔密度提高、面积减小；C4转基因水稻各品系叶片叶肉细胞中叶绿体基粒堆密集，有些基粒类囊体沿长轴方向排列整齐、完整；C4转基因品系的叶鞘均比对照品种粗壮坚韧；除PPDK外，所有转基因品系叶鞘的内外侧维管束及其导管管腔、筛管等执行物质运输功能的组织结构的面积均大于对照品种。【结论】C4转基因水稻叶片气孔多、面积大以及叶鞘维管束结构发达是C4转基因水稻高光效实现的结构前提和基础，与秧苗高的干物质积累相一致。     

转C_4基因水稻的生理表现

以C3水稻原种(WT)和C4玉米为材料,研究了转PEPC+PPDK+ME基因水稻(PKM)的C4光合酶活性、不同光温条件下光合参数和水分利用效率、活性氧代谢等指标。结果表明,PKM水稻饱和光合速率介于WT和C4玉米之间,稍偏向玉米,而水分利用效率与WT接近。由于玉米C4基因的导入,PKM水稻高表达了相关的C4光合酶。在高光和高温条件下,PKM水稻光合速率比原种提高55%以上。另外,虽然PKM水稻光合速率增加,但蒸腾速率亦升高,因此PKM水稻的水分利用效率略有增加,偏向原种。在光氧化条件下,PKM水稻耐光氧化能力进一步增强。     

玉米高光效基因ppdk的克隆及其生物信息学分析

【目的】获得玉米(Zea mays)的丙酮酸磷酸双激酶基因(以下简称ppdk),并对其进行生物信息学分析。【方法】使用Trizol提取玉米SC704的总RNA,并用特异引物对其进行RT-PCR扩增,将得到的cDNA片段连接到pGEM-T载体后转化大肠杆菌DH5α,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析。【结果】获得的玉米PPDK基因CDS全长2 781 bp,与玉米z561ppdk基因同源性为99%;其编码的多肽链包含926个氨基酸,与玉米PPDK同源性为97%。【结论】克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因,它所编码的氨基酸序列具备PPDK蛋白的保守序列和催化活性中心区域。该基因的成功克隆为今后利用其改造C3植物的光合效率以提高粮食单产奠定了良好的基础。     

板栗丙酮酸磷酸双激酶基因的克隆与序列分析

为探索板栗PPDK基因功能以及花粉直感效应分子机理,以板栗果实为材料,根据已登录的拟南芥、桃树、巨桉等多种其他植物物种的PPDK基因序列的保守区,设计特异性引物。利用RT-PCR技术克隆出板栗PPDK基因的编码区,并进行序列分析。结果表明,该基因长为3 293bp,包含一个完整的ORF,长2 676bp,编码892个氨基酸,分子量为97.89KDa。所编码的氨基酸序列与已知植物来源的若干PPDK基因相比,同源性大多在85%以上,证明所克隆的目的片段为PPDK基因,并将该序列登录到GenBank,登录号为KU234550。在PPDK基因所编码的氨基酸序列中发现了一个磷酸烯醇式丙酮酸利用酶磷酸化位点标记,一个拉链结构和多个磷酸化位点。同时推测出多肽链中有规则重复的构象,并同源建模PPDK蛋白整条肽链的三维空间结构。试验认为PPDK基因可能通过影响板栗光合作用进而使板栗在果实大小、淀粉含量等方面表现出明显的花粉直感效应。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt(潮霉素磷酸转移酶基因),经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。     

C_4作物耐冷性研究进展

C4光合作用是最高效利用光照、水分和氮气进行碳固定的光合途径;C4植物,如玉米是农业生产中最重要的作物之一,但是C4植物的分布主要局限在热带和亚热带地区。讨论了寒冷气候对C4光合途径和C4作物玉米的影响;并介绍了一部分能适应寒冷气候的C4植物及其耐冷机制,指出通过增加丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase,PPDK)及其有关调节蛋白含量,并适度增加Ru BP羧化酶(ribulose bisphosphate carboxylase,Ru Bis CO)含量,可以提高C4作物玉米等的耐冷性。     

Relationships Between C4 Enzyme Activities and Yield in Soybeans (Glycine max (L.) Merr.)

To study the relationships between C₄ enzyme activities and yield, C₄ enzyme activities (phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPCase), NADP-malate dehydrogenase (NADP-MDH), NADP-malic enzyme (NADP-ME), and pyruvate phosphate dikinase (PPDK)) in different organs of ten soybean cultivars with different yields were measured at different growth stages in China. The result showed that four enzyme activities in C₄ pathway were obviously different among cultivars, especially PPDK activity was not detected in the leaves of Dongnong 1567 and Dongnong 1068 and the young leaves of Gongjiao 9107-1 and Dongnong 97–172, but there were weak activities in pod coats. The order of C₄ enzyme activities is young leaves < old leaves < pod coats. The correlation coefficients between PEPCase activity and yield and between NADP-MDH activity at blooming stage and yield were 0.6979 and 0.6565, respectively, and both reached the significant level (5%), and PEPCase activity kept significant positive correlation with plant photosynthetic rate. There was a negative correlation between NADP-ME activity and yield, and no correlation was found between PPDK activity and yield.     

Response of Gas Exchange and Water Use Efficiency to Light Intensity and Temperature in Transgenic Rice Expressing PEPC and PPDK Genes

Aiming to controvert whether the photosynthetic capacity of transgenic rice expressing C4 genes is enhanced, with the C3-type untransformed rice （WT） and maize （a C4 plant） as controls, the activity of C4 photosynthetic enzymes, gas exchange parameters and water use efficiency （WUE） under different light intensities and temperatures, the stable carbon isotope ratio （8-3C） value and the metabolic index of active oxygen as well as plant yield parameters were determined in transgenic rice carrying the PEPC and PPDK genes （CK） in this study. The results showed that the light-saturated photosynthetic rate of CK was intermediate between that of WT and maize, with a slight bias towards that of maize. Under a high light intensity （1 200 μmol m^-2 s^-1） and high temperature （35℃）, CK still exhibited higher photosynthetic capacity, while the Gs decreased. The WUE of CK was only slightly increased, and was similar to that of WT. The δ13C value indicated that CK functioned as a C3 plant. In addition, the tolerance to photo-oxidation and grain yield of CK was enhanced by sprayed with NaHSO3. In conclusion, CK possesses higher photosynthetic productivity under the conditions of high photon flux density （PFD）, high temperature and spraying with NaHSO3 solution, thereby providing a new technical approach and physiological basis for constructing C4-like rice.     

毛竹茎秆快速生长期光合关键酶活性及基因表达分析

  目的  揭示毛竹Phyllostachys edulis快速生长期茎秆光合碳同化规律。  方法  以毛竹笋竹为试材,采用分光光度法测定了毛竹茎秆和成熟叶片核酮糖-1,5-二磷酸氧合酶(Rubisco)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)、NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)、PEP羧激酶(PEP-CK)、磷酸烯醇式丙酮酸双激酶(PPDK)活性,运用实时荧光定量聚合链式反应(qPCR)对相应部位光合关键酶基因相对表达量进行分析。  结果  茎秆7~19节间Rubisco活性均极显著低于叶片(P＜0.01),随着节间的升高,Rubisco活性逐渐降低;茎秆中PEPC、NADP-ME、NADP-MDH、PPDK活性在第7节间最高,分别是叶片的3.01倍、5.69倍、4.46倍、4.05倍(P＜0.01),随着节间的升高,酶活性均极显著降低(P＜0.01)。茎秆中PePEPC、PeNADP-ME、PeNADP-MDH、PePPDK基因表达量在第7节间最高,分别是叶片的3.48、7.89、6.48、3.46倍(P＜0.01),随着节间的升高,这些基因表达量均极显著降低(P＜0.01)。  结论  毛竹快速生长期茎秆主要以NADP-ME和NAD-ME途径对竹腔内部高浓度二氧化碳(CO₂)再固定,减少自身碳损耗,形成的碳水化合物被茎秆快速生长再利用。图13表1参37     

利用转基因技术培育超高产水稻

利用植物遗传工程技术将控制植物光合作用、叶片衰老以及淀粉合成的有关基因，如FEP羧化酶（PEPC）基因、丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）基因、NADP－苹果酸酶（NADP－ME）基因、异戊烯基转移酶（IPT）基因、ADP葡萄糖酸化酶基因，进行合理构建后导入水稻，创造出光合效率高、叶片不早衰、种子淀粉合成得以改善的新的水稻种质，从而使水稻产量得以显著提高。     

土壤干旱对小麦旗叶和穗器官C_4光合酶活性的影响

 研究了土壤干旱胁迫下小麦旗叶和穗器官C4途径主要酶及RuBP羧化酶活性变化的差异及其与光合性能的关系。结果表明 ,穗光合活性对水分胁迫的敏感性低于旗叶叶片的 ,在水分胁迫下穗光合速率下降幅度远小于叶片 ,这种差异与各器官C4途径酶活性的相对强弱及其对水分胁迫的响应程度不同有关。穗器官具有比叶片较高的C4酶活性 ,在轻度水分胁迫下 ,旗叶和穗器官的C4途径酶活性被诱导增强 ,其增强幅度以穗器官的高于叶片的。重度胁迫下外稃仍保持较高的C4酶活性 ,而叶片酶活性却下降。穗器官相对较高的C4酶活性及其在水分胁迫下诱导增加的特性可能是逆境下穗光合保持相对稳定的重要原因。     

除莠霉素A对稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的影响

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ）是Ｃ４植物的光合关键酶，１００ｍｇ／Ｌ除莠霉素Ａ对ＰＥＰＣ活性有完全的抑制作用，而对Ｃ３植物的光合关键酶１，５－二磷酸核酮糖羧化酶（ＲｕｂｉｓＣＯ）的活性却没有影响。