蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

 【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号：DQ352145),该基因全长871 bp, ORF框长558 bp, 编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。     

雪花莲凝集素基因(GNA)植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化

将雪花莲凝集素基因(GNA)取代GUS基因正向插入到Ti质粒载体pBI121的35S启动子之下,构建成植物表达载体pBI121/GNA,并将其导入农杆菌LBA4404中.通过该农杆菌介导转化烟草红花大金元,得到卡那霉素抗性植株159株,PCR检测表明其中102株为阳性.对8株PCR阳性植株进行了抗蚜虫生物活性检测,抑制蚜虫密度为25%～90%.     

烟草甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析

为了对植物抗病虫基因工程研究提供依据,以辣椒凝集素基因为探针,通过电子克隆方法从烟草栽培品种K326中克隆甘露糖结合凝集素基因,并对其进行了序列分析。结果表明:从烟草栽培品种K326中克隆出NtMBL1、NtMBL2和NtMBL33种甘露糖结合凝集素基因;3种凝集素cDNA序列均包含完整的开放读码框,编码298个氨基酸,具备B-凝集素结构域,与辣椒凝集素蛋白的一致性较高。经SWISS-MODEL同源模建分析,NtMBL1、NtMBL2和NtMBL3的蛋白模型由8～9个β片层组成的β桶结构,具有与单子叶植物甘露糖结合凝集素相似的空间结构。     

GNA和ACA双价转基因烟草培育及其抗蚜研究

蚜虫是一种常见的农作物害虫,作为多种植物病毒的载体而成为影响农业发展的重要害虫之一,对蚜虫的防治一直是众多科学工作者所面对的难题。构建了雪花莲凝集素(GNA)和苋菜凝集素(ACA)双价植物表达载体pBI121-GA,在农杆菌介导下,叶盘法转化烟草NC89,得到卡那霉素抗性植株65株。通过基因组PCR、ELISA、RT-PCR和Western-blot等分子生物学检测,从中筛选出外源凝集素不同表达水平的转基因烟草5株。对筛选出的5株转基因烟草植株进行初步蚜虫抗性实验,证实转基因烟草对桃蚜表现出一定的抗性,最高抑制率达85.8%,为农作物双价抗蚜基因的应用研究提供一定的理论基础。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

WRKY35转录因子的cDNA克隆与植物表达载体的构建

文章以丁香假单孢菌处理的哥伦比亚型拟南芥为植物材料,利用RT-PCR技术获得了拟南芥WRKY35转录因子的cDNA编码序列。序列分析表明,WRKY35核苷酸序列长1363bp,CDS全长1314bp,编码438个氨基酸,含有一个典型的WRKY结构域,具有WRKY转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pBI121中,成功构建了拟南芥的WRKY35基因的植物表达载体,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

尾穗苋凝集素（ACA）基因植物表达载体的构建

尾穗苋凝集素（Amaranthus caudatusagglutin in,ACA）是一种存在于尾穗苋种子中的贮藏蛋白,属苋菜凝集素家族,对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等有明显的致死作用。植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS带有35S启动子及终止序列、卡那霉素（Kan）抗性基因NPTⅡ。载体pGEMT-ACA含有ACA基因,通过PCR扩增出ACA基因。把植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS和扩增后的ACA基因用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后经连接酶连接,得到植物表达载体pCAMB IA2300-ACA。将该载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404进行保存。     

不同地区半夏无机元素含量分析

测定了6个半夏居群及其土壤样品中的6种人体必需元素,以了解半夏对元素的富集能力和分布规律,为其品质评价提供依据。结果显示:不同居群半夏及其土壤的元素含量存在着显著性差异;同一居群的半夏和土壤元素含量不具有相关性;半夏皮中元素含量最高;药材元素含量相关性显示Zn和Se、Fe和N i、Fe和Ca具有协同吸收特点;富集系数表明半夏对元素富集能力较低。     

栽培措施对半夏倒苗率和产量的影响

[目的]探索能够降低半夏倒苗率、提高半夏产量的栽培措施。[方法]用珍珠岩和土壤为基质,分别设9个处理栽培半夏,分析施肥措施对其倒苗率和产量的影响。[结果]以珍珠岩为基质的半夏产量极显著高于以土壤为基质的半夏;不同的施肥量对半夏的产量和倒苗率有极显著的影响。[结论]种植半夏以珍珠岩为基质,基本营养液浓度为1/5MS,施以浓度为100 mg/L的KH2PO4效果最佳。     

潜半夏种植气候特征及气候风险研究

利用潜江市农业农村发展中心潜半夏资料和潜江市气象站1980—2019年气候资料,分析潜江市气候生态特征对潜半夏人工种植的影响,探讨潜半夏种植存在的气候风险。结果表明：潜半夏生长受气候条件影响很大,人工种植潜半夏生长主要风险为寒潮、高温、暴雨、干旱,其中高温风险最大。半夏种植地建议选取排水灌溉设施齐全、地势高的田块,高温时应采取遮阴防御方法,可采取仿野生式与大豆、油菜或棉花套种方式种植。     

小拱棚栽培半夏需水规律及干物质动态变化研究

通过对小拱棚栽培半夏需水规律和干物质积累的研究，为半夏规范化栽培提供依据。以清水县主栽的山东济宁半夏为试验材料，对温室盆栽半夏设置高、中、低三种水分作为处理，每天称重，记录耗水量，研究半夏的需水规律；在不同生育阶段每处理随机取一盆半夏，测定半夏的根系、块茎、珠芽和叶片的鲜重和干重，研究半夏干物质积累。结果表明，小拱棚栽培半夏以中土壤水分处理为最优处理，其需水规律表现为前期小，中期大，后期小的特点，即出苗初期RH55-70%，齐苗期、快速生长期、珠芽生根发芽期RH70-85%，灌浆期和成熟期RH55-70%为最佳土壤湿度，其需水临界期为珠芽生根发芽期；半夏块茎的干物质积累从播种至快速生长期持续减少，从珠芽生根发芽期至成熟期持续增加；珠芽的干物质积累从发芽后开始持续增加；根系和叶片的干物质积累从生根发芽后至快速生长期持续增加，从珠芽生根发芽期至成熟期持续下降。     

可见-紫外分光光度法测定半夏硫熏前后总生物碱的含量

[目的]考察硫熏对半夏总生物碱含量的影响。[方法]采用可见-紫外分光光度法测定硫熏和非硫熏半夏中总生物碱含量。[结果]比较得出,硫熏后半夏的总生物碱含量明显降低。[结论]半夏产地加工应抛弃硫熏法,探索无硫加工工艺。     

半夏不同居群的细胞学研究*

 研究采用BSG去壁低渗法，对采集于不同地区、不同居群的半夏(Pinellia ternata)进行细胞学研究。研究结果表明：除文献已报道的半夏属有7，8，9和13四个染色体基数外，本研究发现,该属还存在10和23两个染色体基数，并发现半夏存在2n=75，80，84，66，92，100等染色体数目为本研究首次报道，同时分析讨论了不同居群半夏染色体倍性及数目多样性的关系。     

用RAPD标记分析不同居群半夏的遗传多样性

 以我国15个省区23个不同居群半夏为研究对象，探讨了半夏在分子水平上的遗传多样性。研究结果表明：在24条引物中筛选出4条引物，经过PCR扩增共得到32条扩增带，其中28条表现为多态性条带，多态性变异率为87.4%。在23组不同材料之间多态性变异率最高的是I组的DNA，为73.7%；最低的是L ₁组的DNA，变异率为18.2%；平均为44.0%。不论是居群间还是居群内，变异程度都较大。     

施肥对西北地区各等级半夏总生物碱含量的影响

采用N、P、K肥三因素五水平二次通用旋转组合设计研究了半夏在人工栽培条件下施肥对总生物碱含量的影响.结果表明:影响半夏各等级总生物碱含量的主要因素是N肥;最可取的施肥方案为纯N 419.5~514.1kg.hm-2、K2O 150 kg.hm-2,不施P肥,此时可兼顾各等级半夏总生物碱含量都较高.     

半夏丛枝菌根真菌侵染模式及侵染率动态变化

通过染色镜检法观察栽培及野生半夏丛枝茵根,研究其类型、结构,阐述栽培及野生半夏丛枝茵根真茵的侵染模式及全年中侵染率的动态变化.结果表明:半夏根内存在茵丝、丛枝、泡囊等典型丛枝茵根结构,茵根结构类型包括Arum型、Paris型及其交叉型等.丛枝茵根真茵对半夏的侵染率随季节变化而变化,从早春开始上升.夏秋季达到顶峰.而后开始下降;且同一季节中丛枝茵根真茵侵染率野生半夏高于栽培半夏.表明,野生半夏生长环境更适宜丛枝茵根真菌生长,栽培半夏退化可能与半夏共生真菌有关.     

中药半夏的研究进展

把中药半夏生物技术、种属鉴定及分类,化学成分的研究进展作以概括,为半夏的进一步深入研究提供信息和借鉴。分析近几年来国内对半夏的研究报道,进行归纳整理。半夏生物技术的研究主要集中在其栽培、组织培养等方面,在其种属鉴定方面的研究也比较成熟,但关于有效成分及其调控机理和有效成分代谢等方面的研究较少。因此为了适应国际市场的需要应加大对半夏的药效成分及其调控机理的研究。