月季ISSR-PCR体系的建立

通过研究月季杂交品系的遗传多样性,解决其在月季品种中的分类问题.本试验利用正交设计,从Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶和模板DNA 5种因素和4个浓度水平来优化月季杂交品系ISSR-PCR反应体系,其建立的最佳反应体系为:在25μL反应体系中分别加入Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTPs 2.0 mmol/L、引物10μ mol/L、Taq酶0.4 U、模板DNA 20 ng/25μL,并含2.5μL的10×PCR Buffer(Mg2+ free)加dd H2O至25μL.此ISSR-PCR反应优化体系为进一步利用ISSR分子标记技术进行月季遗传多样性分析奠定了良好的技术条件和试验基础.     

油菜黑胫病菌 ISSR-PCR 反应体系优化

通过正交试验设计,对油菜黑胫病菌ISSR-PCR 反应体系的各影响因素进行研究,即从 Taq 酶、Mg2＋、dNTPs、引物以及模板浓度5因素4水平进行优化,筛选并建立了适合油菜黑胫病菌ISSR分子标记的最佳反应体系,即在25μL反应体系中包含Taq DNA酶1 U,Mg2＋2．0 mmol/L,dNTPs 0．2 mmol/L,引物0．6μmol/L,模板40 ng以及2．5μL 10×Buffer。并以扩增条带丰富、清晰、稳定性强为原则,从所查找的110条引物中筛选出24条适于油菜黑胫病菌ISSR-PCR扩增的引物,同时对各引物的最佳退火温度进行了筛选确定,经对20株病原菌的稳定性检测,证实该优化体系可用于研究该病原菌的遗传多样性。     

枇杷ISSR扩增反应体系的优化

采用正交设计对影响枇杷ISSR-PCR的模板DNA、dNTPs、Primer、Taq酶及Buffer(含Mg2+)进行优化。试验结果表明:20μL反应体系中,含模板DNA5ng、dNTPs0.25mmol/L、Primer0.25μmol/L、Taq酶0.5U和10×Buffer(含Mg2+)3μL。此外,从95条ISSR引物中筛选出11条具有丰富的多态性位点的引物,同时优化各引物退火温度。     

萝卜基因组DNA RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

对影响PCR反应的主要因子———模板DNA、引物、dNTPs和Mg2 浓度进行优化,建立起适合于萝卜基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系。RAPD反应体系(18μl)为随机引物0.4~0.6μmol/L,dNTPs0.15~0.2mmol/L,Mg2 2.0mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.8U;ISSR反应体系(16μl)为引物0.5μmol/L,dNTPs0.16mmol/L,Mg2 2.5mmol/L,模板DNA10~40ng,TaqDNA聚合酶0.64U。对扩增程序中复性温度进行了梯度PCR试验,表明35~42℃(37℃)与52.4~58.3℃(55℃)分别适于萝卜基因组DNA的RAPD-PCR和ISSR-PCR反应;应用优化的RAPD和IS-SR反应体系对17个萝卜品种进行了鉴定分析。研究结果将为萝卜分子育种、品种鉴定与种子纯度检测提供重要的技术基础。     

长柄石杉ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

长柄石杉ISSR反应体系的建立能为利用ISSR标记技术进行长柄石杉品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定良好基础。利用正交试验设计的方法,从dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素,对长柄石杉ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度进行梯度检测。结果表明,20 μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、300 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg2+、1.75 U Taq DNA聚合酶、40 ng模板DNA。该优化体系的建立为下一步进行长柄石杉ISSR分子标记奠定了基础。     

东方百合试管苗ISSR-PCR体系优化及引物筛选

为了对东方百合杂交育种获得的大量杂种后代进行分子标记早期鉴定,本研究采用单因素试验方法对模板DNA、Mg2+、Taq DNA聚合酶、d NTPs、引物等因子设置不同浓度梯度,建立了东方百合试管苗叶片ISSR-PCR最佳反应体系。反应体系为20μL,内含1×PCR Buffer、模板DNA 20 ng、Mg2+2.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.7 U、d NTPs 0.3 mmol/L、引物0.4μmol/L。PCR扩增程序采用Touchdown-PCR程序。利用优化后的体系对46条ISSR引物进行筛选,最终筛出3A37、3A61、UBC840、UBC841、UBC844等5条多态性高,重复性好的引物,且引物序列以二核苷酸重复序列为主。本研究可为利用ISSR分子标记开展东方百合杂种真实性鉴定提供技术方法和支持。     

小桐子基因组DNA的提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为从小桐子嫩叶中提取高质量的基因组DNA.采用改良CTAB法提取的基因组DNA通过OD260/OD280比值测定,琼脂糖凝胶电泳和ISSR-PCR扩增检测,结果表明改良CTAB法提取的DNA纯度高.可作为ISSR分子标记的模板.同时,采用正交设计的方法,对影响小桐子ISSR-PCR反应体系中的4个因素(引物、Taq DNA Polymerase、10xBuffer(含Mg2 )、dNTPs)在3个水平上进行优化试验.建立了适合小桐子的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR最优反应体系,即20μl的反应体系中含有30ng模板DNA、0.2mmol/L dNTP、0.3 U Taq酶Polymerase、0.8μmol/L Primer、3.0hanoi/L10×Buffer(含Mg2 ).     

砂仁及其混伪品益智仁的ISSR分子鉴别

为创建砂仁及其主要混伪品益智仁的ISSR分子鉴别方法,以UBC818为引物,对影响ISSR-PCR反应体系的引物、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶和Mg2+浓度进行5因素4水平正交优化试验,并在此基础上筛选阳春砂ISSR引物及砂仁正伪品的鉴别引物。结果表明,20μL阳春砂ISSR-PCR最佳反应体系包括引物0.5μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、DNA模板40 ng、Taq DNA聚合酶1.2 U、Mg^2+2.0 mmol/L;从52条ISSR引物中筛选出10条阳春砂ISSR引物,从6条阳春砂和益智的共同引物中,筛选出扩增条带清晰、多态性强的砂仁正伪品的鉴别引物UBC808,利用UBC808对15份样品进行验证试验,结果表明鉴别体系稳定性好,可用于砂仁与益智仁的快速、准确鉴别。     

萝卜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对萝卜ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验。研究结果表明,获得了最佳的反应体系,在10μL反应体系中,含TaqDNA聚合酶0.6U﹑Mg2+2.0mmo/L﹑模板DNA 40ng﹑dNTP 250μmol/L﹑引物0.25μmol/L﹑10×PCRBuffer,不足部分以ddH2O补足。确立了以UBC876为引物的最优反应条件,退火温度为48℃,总循环数为40次。新优化的萝卜ISSR-PCR的反应体系和程序有很好的重复性和稳定性好。此研究为今后利用ISSR技术对萝卜进行种质资源分类﹑遗传图谱构建和基因定位奠定了基础。     

凤仙花属植物SSR-PCR反应体系的建立与优化

SSR-PCR反应体系的建立与优化是凤仙花属植物(Impatiens L.) SSR标记研究的基础,本研究以8种凤仙花属植物为试材,对Mg~(2+)、Taq酶、dNTPs浓度、DNA模板、引物浓度等5因素进行L_(16)(4~5)正交试验,探讨适合凤仙花属植物的SSR-PCR反应体系,并对主要因素进行优化。结果表明:Mg~(2+)、Taq酶和dNTPs浓度3个因素对凤仙花属SSR-PCR扩增结果有显著影响,影响程度为Mg2+Taq酶dNTPs浓度DNA模板引物浓度;20μL为最佳反应体系,其中,2.6 mmol/L (含10×PCR Buffer)的Mg~(2+),1.6 mmol/L的dNTPs,2μmol/L的引物,60 ng的DNA,0.1 U的Taq酶,ddH_2O补齐剩余部分。利用优化后的反应体系对同属54种材料进行PCR扩增,扩增产物在130～200 bp,具4个等位基因,目标条带清晰,多态性良好。该体系的建立可为今后利用SSR标记对凤仙花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。