绿色荧光蛋白标记解淀粉芽孢杆菌Bam22在油菜体内的定殖

研究GFP标记的解淀粉芽孢杆菌Bam22在油菜植株上的定殖规律,为其开发利用提供科学依据.采用自然转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pGFP4412导入Bam22细胞中,构建GFP荧光标记菌株;对比野生型菌株Bam22与标记菌株Bam22-GFP的生长曲线和抑菌能力;通过灌根法,观察标记菌株在油菜体内不同组织部位的定殖...     

生防枯草芽孢杆菌Kct99的GFP标记及其在甘蓝根部的定殖示踪

将含有绿色荧光蛋白基因的质粒pGFP4412,电击转入生防菌株枯草芽孢杆菌Kct99,获得具有良好发光表型的荧光标记菌株gfp-Kct99。经稳定性测定表明,质粒pGFP4412在gfp-Kct99中的遗传稳定性为89%。平板对峙培养和温室盆栽接种试验显示,标记菌株gfp-Kct99对甘蓝枯萎病菌保持了原有的拮抗活性;以标记菌株和野生型菌株培养液对甘蓝盆栽苗灌根处理5 d后再接种病原菌,对甘蓝枯萎病的防治效果分别为87.7%,90.2%,二者无显著性差异,但均显著高于同时接种生防菌和病原菌、接种病原菌5 d后再接种生防菌2种处理,说明,绿色荧光标记菌株gfp-Kct99抗甘蓝枯萎病的活性未受标记基因的影响。借助荧光显微镜观察表明,标记菌株可以在甘蓝根部表皮内大量定殖,从而阻止病原菌的侵入。     

黄瓜枯萎病生防芽孢杆菌的定向筛选及其抑菌活性物质特性分析

研究拟从北京郊区黄瓜根际土壤中定向筛选黄瓜枯萎病菌生防芽孢杆菌,并研究其抑菌活性物质的基本特性。采用热处理和形态观察结合平板对峙法定向筛选黄瓜枯萎病菌拮抗菌。从北京郊区黄瓜根际土壤中定向分离到63株产芽胞的菌株,从中筛选到2株对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.cucumarinum Owen.）具有较好拮抗作用的菌株,命名为j-28和j-50。拮抗菌j-28对黄瓜枯萎病菌的抑菌带达到11.0 mm。此外,拮抗菌j-28有较广的抑菌谱,对黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、马铃薯干腐病菌（Fusarium sulphureum）和茄子黄萎病菌（Verticilllium albo-atrum）等具有很强的拮抗作用。经过形态观察、理化分析和分子鉴定,j-28和j-50鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。研究还发现拮抗菌j-28的发酵液经过高温和强酸碱处理后抑菌效果会明显减弱,说明拮抗菌j-28产生的主要抑菌活性物质可能是蛋白类。笔者定向筛选到针对北京郊区多发的黄瓜枯萎病菌拮抗菌枯草芽孢杆菌j-28,具有潜在的应用价值,为今后北京郊区黄瓜枯萎病菌的防治提供新的生物防治资源。     

植物叶片提取物对枯草芽孢杆菌抑制石榴枯萎病菌的反应

为评价利用生防细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和果树多样性间栽控制石榴枯萎病（Ceratocystis fimbriata）的作用效果,本研究测定了生防菌株枯草芽孢杆菌BS9601-Y1、Y2对石榴枯萎病菌的抑制作用、石榴园间作树木小枣、枇杷、桉树和石榴叶片乙醇粗提物对石榴枯萎病菌和生防菌生长的影响。结果表明：枯草芽孢杆菌对石榴枯萎病菌的拮抗作用为：BS9601-Y2高于BS9601-Y1,但当菌株培养48 h后,对石榴枯萎病菌的抑制率均达到100%。在供试叶片材料中,1 mg/mL的小枣和枇杷叶片乙醇粗提取物对石榴枯萎病菌的抑制效果较高,分别为29.1%、44.6%;4种叶片乙醇粗取物对生防菌的抑制作用较强,在0.5 mg/mL时,抑制率都达到了98%。由此推测,石榴园间作树木叶片的提取物影响了枯草芽孢杆菌的增殖;在石榴园不能同时使用间栽果树和施用枯草芽孢杆菌剂的方式来控制石榴枯萎病。     

一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌的构建研究

为了选育一种非抗性、高产出、遗传稳定性好、低生产成本的L-赖氨酸生产菌株,以辣椒花药和枯草芽孢杆菌为试验材料,以穿梭表达载体pHT43和基因敲除载体pK18mobsacB为媒介,将辣椒花药中的高赖氨酸基因CFLR转化到枯草芽孢杆菌中。经过2次细胞内同源交换和培养基筛选,最终获得不带质粒抗性标记的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC(B)63501/pK18mobsacB-ΔALA::CFLR,该菌株连续传代20次后仍具有明显高于野生型的CFLR基因拷贝数,经HPLC验证,重组菌株L-赖氨酸含量比野生菌株提高了64.89%。结果表明,本研究所构建的非抗性高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株产量高、遗传稳定性好、低纯化成本,具有良好的应用潜力。     

广谱拮抗菌B96-II的分子鉴定及GFP标记

用PCR方法扩增的广谱拮抗菌B96-II的16S rDNA经序列测定和BLAST同源序列比较,结合传统的形态观察、生理生化特征鉴定,确定了B96-II分类地位为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将含有绿色荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因标记的大肠杆菌一枯草芽孢杆菌穿梭表达载体(pNW33N-gfp-B96-II-N)通过原生质体法转化B96-II,获得表达GFP的4株标记菌株,在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光.室内平板抑菌试验结果表明,GFP标记对B96-II的广谱抑菌活性没有影响.     

棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究

拮抗细菌BDT_25是从根际土壤中分离到的一株对棉花黄萎病菌具有强烈抑制作用的芽孢杆菌。经生理生化特征的鉴定,证明BDT_25菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外,该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用,为一株广谱拮抗细菌菌株。通过对BDT_25菌株培养条件的研究发现,采用NB液体培养基,28℃,170 r/min培养48 h所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。其发酵液经硫酸铵沉淀粗提到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的提取物,进一步实验表明,该拮抗物质对热和多种蛋白酶敏感,证实其为抗菌蛋白。     

烟草内生细菌YN2014042对烟草、玉米的定殖和促生作用研究

为了开发利用烟草内生解淀粉芽孢杆菌YN2014042(YN42),对其在植物上的定殖和促生作用进行了研究。用自然转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pHAPII成功导入YN42细胞中,获得质粒稳定遗传和对烟草黑胫病菌、玉米穗腐病禾谷镰刀菌等13种病原真菌的拮抗能力与野生型YN42相同的GFP标记菌株YN42-GFP。用1.00×10⁷ CFU/g的YN42-GFP分别浇灌烟草和玉米幼苗,在第50天时烟草根、茎和叶组织中仍回收到1.89×10⁶ CFU/g、1.07×10⁴ CFU/g和0.93×10³ CFU/g的菌落;到第25天时玉米叶片中可回收到6.67×10³ CFU/g的菌落;说明YN42在来源寄主和非来源寄主植物中都能稳定地定殖。将YN42添加到烟草育苗基质中制成微生物功能基质,与普通基质对比,1.00×10⁷ CFU/g的菌株基质上的45天烟苗型高、地上部鲜重分别增长450.58%、756.52%;对玉米灌根30天处理,YN42处理的玉米苗型高和地上部鲜重分别增加19.37%和61.42%。研究结果表明YN42对多种病原菌有抑制作用,能在烟草和玉米上稳定定殖,对烟草和玉米的促生作用显著,在农业上具有良好的应用前景。     

枯草芽孢杆菌XZG-11抗菌蛋白对番茄青枯假单胞菌抗菌活性研究

为给菌株XZG-11粗提蛋白的应用提供理论依据,采用硫酸铵分级盐析法分离抗菌蛋白,通过抑菌圈测试法检测其对植物致病真菌和细菌的抑菌活性,并对其生物稳定性进行研究和分析。结果表明,粗提抗菌蛋白对番茄青枯病假单胞菌的抑制效果最强,同时对茄子早疫病菌、番茄灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、赤霉菌、镰刀霉菌也具有较强的抑制作用;对革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均具有强烈的抑制作用,同时还对革兰氏阴性菌如大肠杆菌、绿脓假单胞菌也具有显著抑制作用。抗菌蛋白在pH5.0~11.0范围内较稳定;在80℃以下,热稳定性好,对RNA酶不敏感,对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感。菌株XZG-11粗提抗菌蛋白具有较强的稳定性,对植物病原真菌和细菌具有广谱抗菌活性。     

绿色荧光蛋白标记的枯草芽胞杆菌R31在西芹根际定殖研究

为了更直观地了解植物内生枯草芽胞杆菌R31在西芹根际定殖情况,评估其定殖能力,为西芹黄萎病生物防治提供依据。通过原生质体转化法将携带绿色荧光蛋白基因的质粒pHT315-gfp导入枯草芽胞杆菌R31细胞中,对菌株进行gfp标记,然后利用gfp标记菌株灌根处理西芹苗,研究其在西芹根际的定殖形式和能力。结果获得了携带pHT315-gfp质粒的R31-gfp菌株,该质粒可以在R31细胞中稳定表达,标记菌R31-gfp在蓝光激发下可以稳定发出强的绿色荧光。利用标记菌接种西芹幼苗后,可以在根系表皮检测到绿色荧光膜。对其定殖量的检测发现,接种3天后标记菌在根表和根际土中稳定定殖,定殖量分别达到1.4×10⁴ cfu/g和7.6×10⁴ cfu/g,并长期以该水平稳定定殖,到第65天仍可在根表和根际土检测到9.1×10⁴ cfu/g和3.17×10⁵ cfu/g的R31-gfp。由此得出,R31可以在西芹根表形成菌膜,并在根际长期稳定定殖。     

甘草内生菌Z4菌株对灰霉病菌的作用机制初探

为探究甘草内生菌Z4 菌株的发酵上清液对灰霉病菌的抑菌机制,采用抑制菌丝生长速率法及抑制孢子萌发法,结合扫描电镜和透射电镜,观察Z4 菌株发酵上清液处理前后灰霉病菌菌丝形态结构的变化情况。采用盆栽试验测试活性物质在活体黄瓜内的传导性。通过扫描电镜、透射电镜及光镜观察发现,Z4 菌株的发酵上清液使番茄灰霉病菌菌丝扭曲变形、表面皱缩、部分菌丝断裂;细胞壁溶解破裂,细胞内液泡出现空腔;孢子萌发率低及芽管生长缓慢。盆栽黄瓜灌根和涂叶处理前后,黄瓜的病指分别由82.3 降至28.05 以及83.11 降至30.60,防治效果分别为63.12%和60.28%。表明Z4 菌株发酵上清液对灰霉病菌菌丝细胞的细胞壁具有破坏作用,且活性物质在活体黄瓜内有一定传导性。     

灵芝多糖抑菌活性初探

通过热水提取法提取灵芝多糖,得到灵芝粗多糖,并以3种植物病原菌(胡萝卜欧氏菌、指状青霉、灰葡萄孢)和5种食品有害菌(蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉和黑根霉)为供试菌,采用纸片琼脂法来测定灵芝粗多糖对供试菌的抑菌强度。结果表明,灵芝粗多糖对植物病原菌中的胡萝卜欧氏菌有较强的抑制作用;对指状青霉菌有一定的抑制作用,但抑制作用较弱;对灰葡萄孢几乎没有抑制作用;对食品有害菌中的枯草芽孢杆和蜡状芽孢杆菌有很强的抑制作用;对大肠杆菌和黑曲霉抑制作用相对较弱;对黑根霉几乎没有抑制作用。总体来看,灵芝多糖对细菌的抑菌活性强于真菌。     

番茄灰霉病菌拮抗细菌B21的鉴定

对分离于叶片表面能较强抑制番茄灰霉病菌生长的拮抗细菌B21菌株进行了鉴定。通过形态特征、生理生化特征观察,利用PCR技术对菌株B21 16S rDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B. subtilis 16S rDNA序列（登陆号AY172513）有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。确定B21为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的一个菌株。     

中药白鲜皮内生细菌TS-5生化特性及对番茄灰霉病菌的抑制作用

为了探求中草药植物内生菌对植物病原菌的抑制作用,采用对峙试验、活体防效测定、革兰氏染色、芽孢染色以及生理生化特性、生长条件测定等方法,研究了从中药白鲜皮中获得的一株内生细菌TS-5对灰霉菌的抑制作用。试验结果表明,此内生细菌对灰霉菌有较强且稳定的抑制作用,在培养皿对峙试验中,抑菌带达10 mm,在活体上对病害的抑制率为33.72%;经形态学观察和生理生化反应,确定此菌株属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;其最适生长温度为30℃,最适pH值为7,最佳培养时间为48 h,通气量越大菌株的生长情况越好。     

酥梨采后灰霉病生防菌株的鉴定及抑菌作用

以微生物拮抗病原菌是防治病害安全高效的可行手段。通过对果实表面微生物进行筛选鉴定,以期得到一株可以有效抑制灰霉病的生物防治菌株。对拮抗菌株H-1进行形态学特征、生理生化特性分析,结合16S rDNA序列分析和gyrB 基因序列分析构建系统发育树;采用平板对峙法结合果实伤口试验考察拮抗菌H-1在体外及梨果表面的抑菌作用。结果表明：经鉴定H-I菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;B. velezensis H-1在体外条件下可显著抑制灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、细极链格孢（Alternaria tenuissima）和串珠镰孢菌（Fusarium verticillioides）的菌丝生长,其中对灰葡萄孢霉菌丝的抑制作用最强;果实伤口试验表明,1×1011 CFU/mL的B. velezensis H-1可完全抑制梨果表面灰霉菌生长。由此可见,B. velezensis H-1可以有效抑制梨果采后灰霉病的发生。     

枯草芽孢杆菌TR21在香蕉体内及根际的定殖动态

通过浓度梯度诱导法,获得了抗链霉素300 μg/ml、菌落形态及对香蕉枯萎病菌拮抗活性保持不变的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）TR21标记菌株,并采用伤根、灌根和叶腋接种法,研究了其在香蕉体内及根际的定殖情况。结果表明,采用伤根和灌根法接种,标记菌株均能够在香蕉体内定殖和传导,伤根接种定殖总量最大,接种后1 d,球茎中菌量达3.33×106 cfu?g-1,且标记菌株在香蕉根表和根际土壤中也显示出很好的定殖能力,接种后15 d,根表菌量分别为6.18×103 cfu?g-1、5.53×103 cfu?g-1,根际土壤中菌量分别为1.13×104 cfu?g-1、1.04×104 cfu?g-1;2种接种方法中,标记菌株在香蕉体内及根际的定殖动态总体呈下降趋势。采用叶腋法接种,标记菌株仅能在叶片中定殖,其定殖动态表现为“由升到降”趋势。     

草莓灰霉病菌对速克灵的抗性研究

速克灵对草莓灰霉病具有很好的防治效果,但长期、单一使用很容易使草莓灰霉病菌产生抗药性。为合理使用这类杀菌剂,延缓或防止抗药性的产生,笔者通过UV-C诱变草莓灰霉病菌敏感菌株CF1获得了对速克灵具有高抗性的突变株CF1-1和CF1-2,并对抗性突变株的生长量、产孢量和致病力进行了研究,结果表明:CF1-1与CF1-2对速克灵抗性程度高,抗性水平与敏感菌株相比分别增加了484.6倍和911.0倍。抗性菌株在无速克灵的培养基上菌丝生长较敏感菌株弱,产孢量也明显少于敏感菌株;但其引起草莓离体叶片发病较敏感菌株重,病斑大且边缘颜色深;薄片黄瓜测定结果也表明,在无速克灵的情况下,敏感菌株CF1引起发病较重;而在有药条件下CF1受到一定抑制,但抗性菌株仍能致黄瓜片发病。将抗性菌株连续培养7代后对速克灵的抗性仍是相对稳定的。     

荧光假单胞菌工程菌株的构建及对黄瓜枯萎病的防治效果

采用基因工程的方法，将含有2，4-DAPG基因的质粒pMON5122导入到野生型荧光假单胞菌株中，探索了不同热激时间、不同CaCl2浓度和荧光假单胞菌的不同生长时期对转化子形成的影响；研究了荧光假单胞菌工程菌株对黄瓜枯萎病的防治效果。结果表明，荧光假单胞菌生长到OD约0．53时，用0．025mol／L CaCl2处理细胞，热激3～4min，转化频率最高；荧光假单胞工程菌株对黄瓜枯萎病的盆栽防治效果达到75．0％，并且能够提高黄瓜出苗率。