番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料,克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中,转化DH5α,,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明,克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp,用GenBank中的Blastn程序分析表明,其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导,这为克隆番茄WRKY基因全长,进而为番茄抗病育种奠定基础。     

白菜型油菜WRKY基因片段的克隆与表达分析

WRKY转录因子能广泛地参与植物的生物与非生物胁迫反应。为了研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控,首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段, 用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术（real-time relative quantification PCR,以下简称RT-qPCR）检测WRKY基因在ABA(100 μM)诱导不同时段的差异表达。在白菜型油菜中克隆到一段中克隆到一段长度为680 bp的WRKY基因片段和一段长度为933 bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1 h后表达量最高。本实验文成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。     

南瓜CmNAC基因片段的克隆与序列分析

NAC转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子,其家族成员N端含有保守氨基酸序列,C端为高度变异的转录激活区。本项研究以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC、辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440 bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,而后对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析,结果表明所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC。该基因片段具有其他植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。     

蒜芥茄黄萎病抗性相关基因SsWRKY22和SsWRKY33的克隆与表达分析

黄萎病是茄子生产中的重要病害之一,严重影响茄子的产量和品质。WRKY转录因子在植物抗病中扮演着重要的角色,但在茄子黄萎病抗性中的作用不明。本研究从黄萎病高抗材料野生蒜芥茄的转录组数据中,筛选获得WRKY家族中的SsWRKY22和SsWRKY33基因,利用PCR技术克隆获得目的基因,并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明,SsWRKY22和SsWRKY33基因的ORF序列大小分别为528和1 073 bp,编码175个和357个氨基酸;蛋白分子量分别为19.19和40.46 kD,均属于亲水性不稳定蛋白,其中,Ss WRKY22编码的蛋白属于酸性蛋白,而Ss WRKY33编码的蛋白属于碱性蛋白,亚细胞定位预测两个基因编码的蛋白均定位于细胞核上;此外,SsWRKY22和SsWRKY33分别属于Ⅱ类和Ⅰ类WRKY转录因子,具有不同的蛋白结构。系统发育分析结果表明,Ss WRKY22与野生潘那利番茄、番茄和马铃薯中的WRKY22亲缘关系较近;而Ss WRKY33与辣椒中的WRKY33亲缘关系最近。利用RT-qPCR对SsWRKY22和SsWRKY33基因在蒜芥茄不同部位(根,茎,叶)的表...     

番茄中WRKY2基因的克隆

WRKY转录因子在植物应对生物或非生物胁迫的反应及生长和发育中起重要作用,为研究WRKY转录因子在番茄中的功能,本研究根据课题组已经克隆的番茄WRKY转录因子片段设计引物,采用RT-PCR方法,从JA诱导的番茄幼苗中,获得了608 bp的cDNA片段。序列分析表明,该序列含有WRKYGQK保守结构域,与Capsicum annuum WRKY-c序列相似性是79%,与Nicotiana tabacum NtWRKY-7序列相似性是74%,表明已经成功克隆了番茄WRKY2基因片段。     

板栗CmWRKY基因的克隆、序列分析与原核表达

为深入研究板栗WRKY转录因子基因在板栗抗病过程中的分子作用机制,根据板栗转录组数据库分析获得EST序列,利用RT-PCR技术,克隆板栗WRKY转录因子cDNA(CmWRKY)序列,分析CmWRKY基因及其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究。结果表明,CmWRKY基因为1 437 bp,编码479个氨基酸,推测蛋白分子质量为52. 128 96 ku,理论等电点为9. 15,具有2个WRKY保守结构域和2个C2H_2锌指结构域,属于WRKY家族的第Ⅰ组,基因登录号为KY312850. 1。CmWRKY核苷酸序列与巴旦木等植物的WRKY基因一致性均在80%以上,与西班牙栓皮栎WRKY基因一致性最高,达到97%。同源建模表明,CmWRKY蛋白三级结构与拟南芥At WRKY1蛋白结构相似,推测其可能与At WRKY1具有相似的调控功能。分子进化分析显示,板栗CmWRKY与西班牙栓皮栎及核桃WRKY蛋白亲缘关系最近。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,CmWRKY蛋白最佳诱导表达条件为0. 2 mmol/L IPTG在30℃下诱导10 h,蛋白分子质量为56 ku,其主要以可溶性蛋白的形式存在。为板栗CmWRKY基因的生物学功能研究及应用奠定基础。     

海岛棉GbWRKY32基因的克隆及特性分析

利用RT-PCR技术从海岛棉品种新海21中克隆了1个WRKY基因,在GenBank数据库中比对发现其与陆地棉GhWRKY32的序列高度同源,因此命名为GbWRKY32。该基因ORF为1 077 bp,编码358氨基酸,预测分子量为39.288 k D,等电点为5.02。序列分析表明该基因含有一个WRKY保守结构域,锌指结构为:C-X5-C-X23-H-X1-H,属于WRKY转录因子家族Ⅱ类D组成员。GbWRKY32蛋白为疏水性蛋白,不具有跨膜区和信号肽结构。GbWRKY32转录因子不具有转录自激活活性。本研究成功构建GbWRKY32基因的植物表达载体并转入根癌农杆菌EHA105菌株中,这有助于该基因功能的后续研究。     

棉花抗枯萎病相关基因GhWRKY48的克隆及表达分析

棉花枯萎病是影响棉花产量和品质的最重要病害,WRKY转录因子在植物抗病中扮演重要角色。本实验以高抗枯萎病的陆地棉‘中棉所12’为实验材料,以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中筛选得到WRKY基因片段为探针,从陆地棉‘中棉所12’根部c DNA中克隆WRKY转录因子基因。通过多序列比对分析发现该基因属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族,将该基因命名为GhWRKY48。GhWRKY48基因的序列分析发现,cDNA全长为1 074个核苷酸,编码了357个氨基酸,蛋白分子量为3.94 kD,脂肪指数为56.86,等电点6.20,含有1个WRKY结构域及1个C2H2型锌指属于疏水蛋白。基因的蛋白二级结构包括延伸链、α螺旋和无规则卷曲。通过RT-qPCR的结果发现,枯萎病菌处理后,GhWRKY48的基因表达量显著低于对照组,预测该基因可能参与棉花抗枯萎病反应体系。本研究结果为棉花抗枯萎病提供一定的研究思路与途径。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

辣椒推定WRKY基因cDNA的生物信息学分析

本研究在利用同源克隆法分离到一个推定的辣椒WRKY 转录因子的基础上,采用多种生物信息学方法对该序列进行特征分析和功能预测, 以获得该基因及其编码蛋白更多的功能提示。方法: 应用B1ast、ORF Finder、Wolf Psort、DNAMAN等软件或数据库, 进行序列的相似性比较, 开放读码框预测、保守域和编码蛋白质的功能等分析。结果: 我们得到的WRKY序列是该基因家族中的一个全长cDNA序列, 该基因编码的蛋白具有WRKY保守结构域和锌指结构特征, 亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位于细胞核。结论: 辣椒WRKY新基因是一新成员, 进化上保守有保守性, 可能在在调控植物的生长发育以及干旱、高温、高盐等逆境应答过程中起重要调节作用。因此, 这一辣椒WRKY新基因有进一步研究的价值。     

海岛棉GbWRKY40基因的克隆及特征分析

【目的】WRKY转录因子调控多种生物学进程,包括植物生长发育和应答多种环境胁迫。本研究旨在分析WRKY转录因子在海岛棉纤维发育中的功能。【方法】从海岛棉中克隆了1个WRKY转录因子基因GbWRKY40,进行同源性分析、多序列比对,利用荧光定量聚合酶链式反应分析其表达模式,通过构建酵母表达载体并转化酵母菌株AH109研究其转录激活活性。【结果】该基因c DNA全长1713 bp,5'非编码区长261 bp,3'非编码区长510 bp;开放阅读框长942 bp,编码313个氨基酸,预测相对分子质量约为34.138×103,等电点为8.46,包含5个外显子和4个内含子;其编码蛋白含有1个WRKY保守区(WRKYGQK)和1个锌指基序(C-X5-C-X23-H-X1-H),属于WRKY家族第Ⅱ类a组,包含3个核定位信号区,与陆地棉GhWRKY40同源性最高。GbWRKY40在根和开花后25 d纤维中表达量高,而且不具有转录激活活性。【结论】GbWRKY40可能参与调控棉纤维次生壁发育。     

SUSIRI基因的生物信息学分析及亚细胞定位

转录因子是植物生长发育及其对外界环境的应答反应中起重要作用的蛋白调控因子,一般含有DNA结构域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。WRKY蛋白是一类具有重要作用的转录调控因子。在水稻的基因组中预测到的WRKY基因多达103个,对这些基因的功能加以注释具有重要的意义。SUSIRI基因是前人从粳稻日本晴中克隆的一个WRKY家族的转录因子。其开放阅读框长度为1755 bp,可编码584个氨基酸,具有典型的双WRKY结构域。为了进一步研究SSUSIRI基因,阐明它在水稻中的生物调控功能。通过应用生物信息学的方法,对该基因的预测蛋白进行了结构与功能的分析。利用EBI的interpro数据库分析SUSIRI基因序列的基序(motif),并结合NCBI的CDD(conserved domains)数据库分析该蛋白的保守结构域,用DNAMAN软件和CBS的TMHMM软件分析蛋白氨基酸残基的亲（疏）水性特点和跨膜结构域,用CBS的Protcomp version9.0软件和Protfun软件分别分析了蛋白的亚细胞定位和功能预测;通过实验设计把SUSIRI基因与GFP基因相融合,构建了由actin启动子驱动的SUSIRI基因的荧光表达载体pNSUGFP。通过采用基因枪法把该载体转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位鉴定。结果表明,生物信息学预测值显示：SUSIRI基因具有转录、转录调控、信号转导类功能的可能性最高,预测值分别为0.973、1.598和0.602;同时,其参与翻译功能、中间代谢功能和脂肪酸代谢功能的可能性也较大,预测值分别为4.800、1.490和1.265;由于SUSIRI蛋白中含有的亲水性氨基酸残基较多,该蛋白不具有跨膜性,是一种非跨膜类蛋白。对其亚细胞定位预测表明：在其氨基酸序列中含有较强的核定位信号,所以定位于细胞核内的可能性很大。进一步用荧光显微镜对基因枪轰击的洋葱表皮细胞的观察发现：对照的GFP蛋白主要沿细胞壁表达,而SUSIRI-GFP融合蛋白在细胞核中有很强的表达。通过试验研究得出：SUSIRI基因可能是一个参与中间代谢调控功能的基因,主要在基因转录环节发挥作用,是一种核定位蛋白。     

铁皮石斛DoSAMDC-like基因的克隆及原核表达

本研究从药用植物铁皮石斛中克隆得到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosyl-L-methionine decarboxylase)基因(DoSAMDC-like)并进行序列分析和原核表达。SAMDC基因家族具有多个成员,本研究采用同源克隆的方法对铁皮石斛中尚未报道的新成员DoSAMDC-like基因进行克隆,并与拟南芥SAMDC基因家族成员和铁皮石斛基因组注释序列进行比对分析、蛋白质特征及原核表达等分析。基因序列分析表明,DoSAMDC-like基因编码区全长1104 bp,推测编码368个氨基酸,氨基酸序列具有SAM_decarbox超家族共同的保守结构域。多序列比对及进化树结果表明,克隆获得的DoSAMDC-like基因序列对应于基因组测序注释的XM_020825443.2序列,一致性为99.55%,与铁皮石斛SAMDC1基因一致性为80.16%。异源表达结果表明,DoSAMDC-like基因受IPTG诱导,蛋白分子量约为47 kD。DoSAMDC-like基因的克隆和原核表达,可为参与铁皮石斛多胺代谢、生物碱合成相关基因的蛋白质生化活性等研究提供了帮助。     

大豆CML38-like基因的克隆及表达载体构建

类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。     

大蒜几丁质酶基因AsCHI1的鉴定及其对盐胁迫的响应

本研究旨在研究大蒜几丁质酶基因的序列特征及其对盐胁迫的响应,鉴定其抗逆功能。以大蒜品种‘苍山四六瓣’为研究材料,通过RT-PCR技术分离得到AsCHI1基因。采用BioXM 2.6、ProtParam、DNAMAN、SignalP 5.0、SOPMA、SWISS-MODEL、NCBI和MEGA5等软件分析核苷酸及其编码的氨基酸序列特征,利用荧光定量PCR技术检测其在不同组织以及盐胁迫下的表达特性。该基因开放阅读框全长933 bp,编码310个氨基酸,其编码的蛋白属于几丁质酶Class I类,同时隶属于GH19家族成员。氨基酸序列分析显示,AsCHI1在N端含有大多数几丁质酶具备的信号肽区域,在C端与其他物种CHI氨基酸序列一致性较高。在亲缘关系上与同属百合科的麝香百合LlCHI (QBZ68892.1)以及山茶科的茶CsCHI(XP_028075045.1)较为接近。实时荧光定量PCR技术分析表明,AsCHI1基因在大蒜根、蒜瓣和叶片中均有表达,但在根中表达最高。另外,盐胁迫能显著诱导AsCHI1基因在各组织内的表达。说明该基因可能在大蒜植株抵御盐胁迫的过程中发挥重要作用。