青枯菌M5菌株特异基因组消减文库的构建

为筛选青枯菌M5菌株特有的序列,利用SSH技术对青枯菌生理小种5号菌株M5（tester）和生理小种1号菌株GMI1000（driver）基因组进行了比较。分别提取二者基因组DNA,RsaⅠ酶切,将酶切后M5菌株DNA分为两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR扩增,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因/差异DNA片段,与pGEM-T载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,建立消减文库。随机挑取96个白色克隆,经菌液PCR法测定,80个为预期阳性,含有预期的插入片段。首次构建了青枯菌M5菌株特异基因的抑制消减文库,为进一步筛选、克隆青枯菌M5菌株特异核苷酸片段奠定了基础。     

黏类小麦细胞质雄性不育系mtDNA消减文库的构建

本研究利用抑制性消减杂交技术,构建了黏类小麦细胞质雄性不育线粒体DNA的消减文库。分别提取相同细胞质背景下的不育和可育等基因系线粒体基因组DNA(mtDNA),用RsaⅠ酶切成大小不等的片段,并各自与不同的接头连接,连续经过两次消减杂交和两次PCR扩增,将PCR产物与克隆载体连接,转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建差异DNA消减文库。在构建的不育mtDNA文库中,将SSH文库的全部扩增产物与SSH文库中的单条扩增条带分别进行胶回收和克隆转化,分别挑取54个和6个阳性克隆进行测序分析和相关功能初步比对。结果表明,不育mtDNA的SSH文库差减杂交效率较高,质量较好;回收单条扩增条带分别进行克隆测序的结果准确率较高;对测序序列进行BLASTx比对及功能注释分析发现,约90%的序列来源于线粒体基因nad1和nad5的非编码区。     

辣椒育性恢复相关基因消减文库的质量分析

本试验对构建的辣椒育性恢复相关基因的消减cDNA文库进行质量分析.通过对文库构建过程中的各个环节,包括总RNA的提取,mRNA的分离纯化,RasⅠ酶切,接头连接,消减效率检测以及菌落PCR等,进行分析和评估,证明利用抑制消减杂交技术(SSH)所构建的消减文库是准确可靠的,富集了大量与辣椒育性恢复相关的基因,为进一步精确筛选、克隆、分析辣椒育性恢复相关基因奠定了基础.     

基于ISSR和AFLP标记开发甜菜 SSR 引物的研究

本研究以ISSR-PCR和AFLP标记原理为基础,介绍一种新的分离甜菜基因组微卫星引物的方法。首先对甜菜基因组DNA进行酶切并连接已知序列的接头,构建基因组DNA酶切文库,同时用一个或两个ISSR引物,扩增文库中两端含微卫星序列片段并进行克隆测序,根据测序结果设计微卫星序列间的IP1引物和IP1与微卫星序列间IP2 引物;再根据侧翼序列克隆原理,采用巢式PCR进行基因组步移,扩增IP2引物下游序列,根据巢式PCR产物测序结果,设计微卫星序列另一侧的引物IP3 ,IP2和IP3即为SSR标记引物,对获得的SSR引物进行PCR验证,结果表明SSR引物产率为16%,本研究获得的SSR引物具有较高的多态性,对于后续的遗传多样性检测和遗传连锁图构建具有重要意义。     

磁珠富集法筛选马尾松微卫星标记

将马尾松核基因组DNA用Sau3A Ⅰ酶切后,电泳回收300～1 000 bp片段.在回收的片段上连接接头PCR后与用生物素标记的微卫星探针(AC)15、(AG)15杂交运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段.将获得的序列通过PCR扩增后,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星序列文库.然后用PCR法直接对文库进行扩增,获得58个阳性克隆,经测序分析,获微卫星序列33个,并成功设计出马尾松微卫星引物19对.     

山羊基因组文库的构建研究

构建了山羊基因组文库,为筛选山羊乳蛋白基因,构建山羊乳蛋白基因定点整合的转基因敲入载体奠定基础。全血提取基因组DNA,Sau3AΙ部分酶切,分级分离回收15~23 kb片段,将片段插入Lambda BlueSTAR BamHΙ vector,连接并包装后,NotI酶切鉴定。结果表明,文库滴度为3.4×106;共得到1.7×106个有效克隆,插入片断长度在15~23kb范围,成功构建了西农萨能奶山羊基因组文库。     

用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)₁₅与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300~1 500 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)₁₅使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。     

蒙古马MSTN基因第三外显子的克隆及其SSCP研究

依据马肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以蒙古马基因组DNA为模板,利用PCR技术,扩增出MSTN基因第三外显子序列。将所得片段与P^GEM__Teasy载体连接,转化感受态DH5a大肠杆菌。筛选出阳性克隆,酶切、PCR鉴定后,经DNA测序结果表明,所克隆到的MSTN基因第三外显子与文献报道基本一致,有一处单核苷酸有变异。     

利用FIASCO技术进行波纹巴非蛤微卫星

为揭示波纹巴非蛤种质遗传特性、开发种质库,利用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了其基因组微卫星标记的分离与筛选研究。基因组DNA经限制性内切酶Mse I 酶切后与接头连接,用生物素标记的(CA)15或(AAG)7探针与其杂交,然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增后形成双链,最后进行克隆转化,构建微卫星富集文库。挑选克隆用探针引物(CA)15或(AAG)7和载体引物进行PCR筛选,测序得到含有微卫星DNA的序列,根据序列设计和合成微卫星引物,进行引物适用性分析,并分析了湛江群体的遗传结构。结果表明,8对微卫星引物在湛江群体共检测到108个等位基因,每个位点等位基因数为5~19,期望杂合度为0.666~0.926,观测杂合度为0.400~0.882,4个位点(Pun4,Pun5,Pun6,Pun7)显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.00625);PIC介于0.62~0.92,所有位点均属于高度多态位点(PIC>0.5)。说明FIASCO技术适合于波纹巴非蛤微卫星标记的分离与筛选,筛选得到的8个微卫星位点能用于波纹巴非蛤遗传多样性分析及野生群体与养殖群体的群体结构分析。     

利用抑制差减杂交技术分离棕色棉纤维特异表达基因

采用棕色棉新彩棉5号为Tester,其白色近等基因系NIL-C5为Driver,通过抑制差减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个棕色棉纤维色素差异表达基因差减文库.从文库中随机挑选400个克隆,将这些克隆的PCR产物点膜进行反向Northern杂交检测,挑选20个差异明显的克隆进行序列分析,结果表明:有5个cDNA片段与已知的功能基因序列相似,其中1个cDNA片段与合成色素的重要酶基因4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)基因有较高的同源性,其它cDNA片段在数据库中未找到同源序列.     

干旱胁迫下斑茅消减文库的构建及分析

以干旱胁迫下斑茅(Saccharum arundinaceum Retz.)叶片组织的cDNA为Tester，正常生长条件下斑茅叶片组织cDNA为Driver，利用抑制性消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）构建斑茅干旱胁迫消减文库。文库克隆总量约为30 000个，克隆重组率为99.2%；随机从文库中挑取3500个克隆分析表明，插入片断长度主要集中在200~1 000 bp之间，500 bp以上的有463个克隆，500 bp以下的有3 037个克隆，平均长度约450 bp; 通过随机对16个文库阳性克隆的测序及分析，3个克隆与ATP-NAD kinase、Aldo/keto reductase和锌指蛋白高度同源，3个克隆没有同源性，10个与逆境相关，是功能未知的EST。选择编号为EL0149和EL0145两个克隆进行Northern杂交验证，结果表明EL0149克隆为干旱胁迫上调表达的EST序列，而EL0145在正常供水和干旱条件下均无明显的的杂交信号。说明本研究克隆的SSH文库质量较高，可以进一步利用SSH文库结合芯片表达谱分析解析作物水分胁迫下的相关抗旱基因网络。     

应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌4型菌株可能毒力基因

为了寻找副猪嗜血杆菌可能毒力基因,采用抑制性差减杂交技术,以HPS有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)为研究对象,构建差减杂交文库,利用Southern Blot分析和PCR鉴定进行差异基因片段的筛选。从构建的文库中共筛选得到7个特异性差异基因片段,经同源性分析,其中5个片段分别与噬菌体重组蛋白、糖基转移酶/荚膜多糖磷酸转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、核糖体蛋白丙氨酸转移酶和ABC型硝酸盐/磺酸盐/碳酸氢盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性;2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关。利用PCR对上述可能与毒力相关的差异基因片段在9种不同血清型HPS中的分布进行了检测,结果表明,7个片段存在于多数的有毒力菌株(血清4,5,12,14,15型)中,而在无毒力菌株(血清3,11型)中均未检测到。利用SSH技术成功构建了HPS有毒力菌株SW124和无毒力菌株H465的差异表达基因差减文库,筛选获得了7个差异基因片段,且上述片段在HPS不同血清型有毒力菌株中分布广泛。     

苎麻基因组微卫星的分离与鉴定

以苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud.]栽培品种芦竹青为材料,经MseⅠ酶切并与相应接头连接,然后与生物素标记的探针(CT)15杂交,再用链亲和素包被磁珠(Dynabeads M-280)捕捉杂交产物,以21碱基接头寡核苷酸为引物经PCR扩增获得了双链目的片段,回收300~1 000 bp DNA片段,然后克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中,这样就构建了苎麻富含(GA)n微卫星的部分基因组文库。随机挑取36个克隆,以锚定简单重复序列为引物对其进行PCR筛选。测序分析了22个阳性克隆,每个克隆都含有微卫星DNA,阳性克隆率为61.1%,微卫星种类以与探针互补的（GA/CT）_n为主,占83.3%,同时还存在（TG/AC）_n和三碱基、六碱基为单元构成的苎麻微卫星,如(GAC)_n、(ACG)_n、(TCT)_n、(TCG)_n、(GAA)_n、(CCGACG) _n、(GAGAAA)_n等。最后以18个微卫星位点设计了18对苎麻微卫星特异引物。GA/CT重复单元的长度从7到40范围内变化,平均为19.2,显示了它们将产生良好多态性,为一种强有力的遗传标记。苎麻微卫星DNA标记可广泛应用于苎麻基因型鉴定,基因和QTL分析,分子标记辅助育种,系谱分析等。     

大豆花叶病毒侵染初期的抗病性表达序列标签分析

以抗花叶病毒病品系东农8143为材料,利用抑制消减杂交技术构建了一个大豆花叶病毒接种初期的cDNA文库,共获得2000个阳性克隆。随机挑取64个阳性克隆测序,与GenBank进行BLAST_x和BLAST_n同源比较,其中49个有比较明确的比对结果,占测序EST的76.6%。测序的ESTs片段中最短的为136 bp,最长的691 bp,平均长度为456 bp,有41条序列带有Poly(A)尾。功能已知基因的EST涉及大豆的细胞自身保护、信号传导、抑制病原菌生长、系统获得性抗性以及持家基因等许多方面,其中SAR（Systemic aquired resistance）系统基因在表达谱中的种类和数量最多。未知功能ESTs与GenBank的dbEST库中序列比较表明,其中许多与生物、非生物胁迫cDNA文库来源的ESTs同源。     

基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记

分别以二倍体长穗偃麦草和普通小麦中国春的基因组DNA作实验组和对照组,运用抑制消减杂交(SSH)技术去除2个基因组DNA之间的同源序列, 获得长穗偃麦草特异的DNA片段构建的单向抑制消减文库,并对随机克隆测序。根据测序结果设计引物,获得36个长穗偃麦草基因组特异分子标记,成功率高达69.2%。这些标记均能在具有长穗偃麦草E染色体的不同小麦背景和不同世代中稳定表现,可用于小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片段。     

Microdissection of a single chromosome and construction of the microclone library from soybean

A single chromosome was microdissected from the metaphase chromosomes of soybean by using a glass needle. After two rounds of Sau3A linker-adaptor-mediated PCR, smear DNA fragments ranged from 0.3–2.5 kb were obtained. Southern hybridization showed that the PCR products from the dissected chromosome were homologous with the soybean genomic DNA. In situ hybridization of the chromosome PCR products to the mitotic metaphase spreads showed that the PCR products were hybridized to the soybean, but the chromosomal signals were not restricted to the microdissected chromosome. The second-round PCR products from the microdissected chromosome were cloned into plasmid vector to generate a chromosome-specific microclone library, which included approximately 200,000 recombinant clones. 178 randomly selected clones were estimated to range in size from 0.3∼1.8 kb, with an average size of 830 bp, of which approximately 44% were high/medium copy clones, while 56% were low/unique copy clones. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.