贵州省2个猪种APOA5基因比较分析

摘 要：根据GenBank中报道的猪载脂蛋白A5 (apoA5)基因序列设计3对引物,通过PCR方法分别对可乐猪和贵州白香猪的apoA5基因进行扩增、测序,将两个猪种apoA5基因序列进行比对,并找出基因变异位点。结果表明：可乐猪apoA5基因DNA长为2474bp,白香猪apoA5基因DNA长为2473bp,分别包含三个外显子,两个内含子。两猪种apoA5基因编码区长皆为1092bp,编码363个氨基酸。白香猪apoA5基因序列与可乐猪相比,存在12个突变位点,其中6个位点为颠换,5个为转换,1个为缺失,两者核苷酸同源性为99.6%。这为进一步研究猪apoA5基因的多态性、生物学活性以及与猪生产性状相关性研究奠定了一定基础     

地方品种固始鸭γ-干扰素基因的克隆与分子进化分析

根据GenBank发表的鸭γ-干扰素cDNA基因序列,自行设计、合成1对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如ConA、PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接提取总RNA,扩增固始鸭γ-干扰素基因(DuIFN-γ),并进行克隆和测序。测序结果表明,获得了DuIFN-γ全序列,其大小为515 bp,包含一个完整阅读框,编码164个氨基酸残基,推导的氨基酸有3个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列比较分析发现,克隆的固始鸭IFN-γ基因序列与GenBank中4条鸭IFN-γ基因序列中的3条序列(AF087134,AF100929,AJ012254)完全一致,而与另一条北京鸭核苷酸同源性为99.6%,有2个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为98.8%。固始鸭与人和其他种动物的IFN-γ基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-γ基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。DuIFN-γ基因的成功克隆为进一步研究固始鸭IFN-γ基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

糯谷与非糯谷waxy基因全序列比对与多态性位点分析

为了明确粳糯谷子waxy基因DNA全序列及其氨基酸序列多态性,以3份糯质和2份非糯谷子品种为材料,通过Primer Premier 5.0引物设计、PCR扩增、目的片段纯化、阳性克隆和菌液PCR测序拼接,以Setaria italica v2.2 (Foxtail millet)基因为参考序列,分析参试材料间waxy基因全序列的多态性位点,利用在线SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析预测其waxy氨基酸序列及其二级结构域。结果表明,(1)waxy基因全序列总长度为4 218 bp。5份供试材料与参考基因序列比对共检测到54个突变位点,其中转换、颠换(易位)、插入和缺失突变依次分别为24、19、5和6个。(2)‘公谷68’、‘红粘谷’、‘赤谷4号’、‘赤谷9号’和‘杏黄粘’与参考基因序列比对分别含有36、8、5、5和0个差异位点,其中‘公谷68’与参考基因组序列比对,存在Intron 6第2 052 bp (T)和Intron 9第2 883 bp (AGGTG)等5个插入,在Intron 12 (3 602 bp)缺失T,Intron 6 (2 109～2 125 bp)缺失ACATTCTTTCAGACTGC等6个缺失位点,以及Intron 1 (396, 787 bp)(C-A)等12个颠换,exon 1 (54, 68 bp)(A-G)等12个转换。‘红粘谷’Intron 6在2 078 bp (T-A)等含有3个颠换,以及exon 1第54和68 bp、Intron1第201 bp (A-G)等5个转换。(3)粳糯谷waxy基因序列比对中,‘公谷68’、‘杏黄粘’和‘红粘谷’与非糯‘赤谷4号’分别含有31、5和3个多态性位点。(4)粳糯谷之间检测到70个氨基酸序列差异位点,其中‘公谷68’与其余4份材料存在69个差异位点,‘杏黄粘’第248个氨基酸为S (丝氨酸),其余4份材料均为N (天冬酰胺)。‘公谷68’检测到low complexity (51～67)、Pfam:Glyco_transf_5 (81～341)、Pfam:Glycos_transf_1 (385～524)、Pfam:Glyco_trans_1_4 (396～533)和low complexity (580～604)等5个waxy氨基酸序列二级结构域,‘红粘谷’、‘杏黄粘’、‘赤谷4号’和‘赤谷9号’均含有上述前4个结构域,但与‘公谷68’结构域的氨基酸位置不同,其差异氨基酸数目依次分别为0、1、0和12个。     

芥菜型油菜FAE1基因序列特征及其与芥酸含量关系的初步分析

采用同源序列法对6个芥菜型油菜(Brassica juncea)品种(高芥酸、中芥酸、低芥酸)、2份白菜型油菜品种(高芥酸和低芥酸)和1份黑芥品种的FAE1基因进行克隆和测序表明,9个品种的FAE1基因编码区全长均为1522bp,不含内含子,均编码507个氨基酸残基。序列比较表明,芥菜型油菜中有两种FAE1基因序列(BjFAE1.1和BjFAE1.2),其亲缘种白菜型油菜和黑芥中各有一种FAE1基因序列(BrFAE1和BnFAE1),BjFAE1.1对应于白菜型油菜的BrFAE1,BjFAE1.2对应于黑芥的BnFAE1;BjFAE1.1和BjFAE1.2之间存在71bp处核苷酸变异和Hind III不同的酶切位点(第1415位和第1144位),蛋白质水平上存在15处氨基酸变异。比较不同芥酸含量品种的FAE1基因序列表明,BjFAE1.1基因存在2个SNP位点(第968位和第1265位),BjFAE1.2基因也有2个SNP位点(第49位和第237位),这4个SNP位点中有3个位点(第49位、第968位和第1265位)导致蛋白质水平上氨基酸的差异。其中BjFAE1.1基因第968位的碱基变化(C→T)引起的第323位氨基酸变化(Thr→Ile),能够解释芥菜型油菜和白菜型油菜高芥酸到低芥酸(中芥酸)的转变;第1265位的碱基变化(T→C)引起的第422位的氨基酸变化(Phe→Ser),能够部分解释芥菜型油菜的高芥酸到低芥酸(中芥酸)的转变,白菜型油菜的高芥酸和低芥酸品种在该位点的碱基没有变化。BjFAE1.2基因第49位的碱基变化(T→C)引起的第17位氨基酸的变化(Phe→Leu),可以解释芥菜型油菜的中芥酸变成高芥酸(低芥酸)。陕北黄芥低芥酸突变株1278-3的FAE1基因序列和国外低芥酸品种比较,只在第1265位出现变异。     

传染性喉气管炎病毒河南株ILTV-CG GX基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)GX基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,应用PCR技术扩增ILTV河南株(ILTV-CG)GX基因。将ILTV-CG接种10日龄鸡胚,提取ILTV基因组DNA进行PCR扩增。将回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选,对菌液PCR和酶切鉴定为阳性的菌株进行测序。测序结果表明,所克隆的GX基因全长为950 bp,含有一个开放阅读框,编码299个氨基酸的多肽。推导的氨基酸有4个潜在的N-糖基化位点,有11个与二硫键形成有关的半胱氨酸。序列分析表明,克隆的ILTV-CGGX基因与GenBank中发表的ILTV-SA2株GX基因核苷酸同源性为97.2%,变异点为第124位插入1个碱基G,第136位又插入2个碱基C,从而引起该毒株GX基因推导的氨基酸序列在第33位插入1个亮氨酸,还存在多处氨基酸发生变化,氨基酸同源性为95.3%。GX基因的成功克隆为构建ILTVGX基因缺失的病毒活载体奠定基础。     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

谷子6号染色体雄性不育基因的克隆

克隆谷子雄性不育材料1066A的不育基因,分析不育基因与可育基因存在的突变位点,为揭示谷子雄性不育分子机制、利用分子标记辅助选择方法选育多用途的不育材料奠定基础。利用谷子全基因组测序数据及前人不育基因定位结果克隆谷子雄性不育材料1066A的雄性不育基因,发掘导致不育的突变位点,旨在为从分子水平揭示谷子不育机制、利用分子标记辅助选择方法选育多用途的不育材料奠定基础。首先利用生物信息学方法从豫谷1号6号染色体找到1个雄性不育基因位点(Si015780m.g),该基因全长5 027个碱基,编码479个氨基酸,且位于前人用分子标记定位的基因组区间内。根据豫谷1号不育基因序列设计2对特异引物在雄性不育材料1066A的基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产生的2个基因组片段进行拼接后在谷子不育材料1066A中获得2 561 bp的基因序列,包含了下游部分编码区。通过对豫谷1号、张谷、1066A的不育基因部分编码序列及推定的蛋白质序列进行比对分析,结果发现谷子不育材料1066A的不育基因编码序列存在3处突变:2处单碱基替换和1处单碱基插入,这3处突变导致谷子不育材料1066A的不育基因蛋白的第402,403个氨基酸由异亮氨酸和亮氨酸替换成缬氨酸和异亮氨酸,同时导致其不育基因编码的蛋白在第466个氨基酸处发生提前终止。3处突变中2处氨基酸替换对编码蛋白的功能影响不大,因此,认为谷子不育材料1066A的不育基因蛋白翻译提前终止可能是导致其产生不育的原因。     

家蚕黄酮合酶I基因BmFNS I的克隆与干涉载体的构建

黄酮类化合物广泛存在于动植物中,具有多种生理活性,黄酮合酶I基因可以催化多种黄酮类化合物的生物合成.根据NCBI已登录的其他物种黄酮合酶I基因的氨基酸序列,与家蚕基因组和EST数据库进行电子克隆获得家蚕的同源基因BmFNS I.克隆测序结果表明该基因长1 451 bp,7个外显子.根据基因序列推测其编码蛋白由345个氨基酸构成,179～295间氨基酸为一2-氧戊二酸和Fe(II)依赖性的加氧酶家族成员的结构域.RT-PCR检测该基因在本试验所调查的家蚕中肠有高表达.最后将该基因片段亚克隆至具有2个反向T7启动子可以用于体外诱导合成dsRNA的L4440载体.     

猪SLA-DQA基因外显子4多态性分析

采用PCR-SSCP及克隆测序技术对大白、长白、杜洛克共210头仔猪SLA-DQA基因第4外显子进行多态性检测,以探讨猪SLA-DQA基因的遗传特性。结果显示:共获得4种等位基因(A、B、C、D),6种基因型(AA、AB、CC、CD、BB、BC)。6种基因型在杜洛克猪中都被检测到,而在大白猪中只检测到AA、AB、CC 3种基因型,在长白猪中未检测到BC基因型。A等位基因和AA基因型的频率在3个群体中最高,为优势基因和优势基因型。对不同SSCP带型的对应片段进行测序分析,共发现3个核苷酸突变位点(5 126 bp A→G,5 158 bp A→T,5 233 bp G→A),其中,5126 bp处A→G导致氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸。经χ2适合性检验,3个猪品种在此位点上都偏离了Hardy-Wein-berg平衡状态(P<0.05)。群体遗传学分析发现:长白猪、大白猪多态信息含量(PIC)分别为0.3233,0.4548,属于中度多态(0.250.5);各基因型在三品种中的分布差异显著。研究结果证实,猪SLA-DQA基因第4外显子具有丰富的遗传多态性。     

细粒棘球蚴TSP1和TSP6基因的克隆及生物信息学分析

为了研究绵羊细粒棘球蚴重要抗原基因Tetraspanin 1-TSP1(TSP1)和Tetraspanin 1-TSP6(TSP6)的功能,对Gen Bank中Eg基因组数据库检索,获得TSP1和TSP6的c DNA序列并设计特异性引物。以Eg头节为总RNA模板,进行RT-PCR,将PCR产物克隆到p MD19-T载体后测序并进行生物信息学分析。TSP1 c DNA全长792个核苷酸,编码263个氨基酸,该多肽含有3个潜在的N端糖基化位点,2个N端酰基化位点,与已登录的标准株TSP1基因序列(EG_11043)同源性为98.99%,其推导的氨基酸序列同源性为98.48%;TSP6 c DNA全长666个核苷酸,编码221个氨基酸,该多肽含有5个N端酰基化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,与已登录的标准株TSP6基因序列(EG_00715)同源性为98.18%,其推导的氨基酸序列同源性为85.07%。运用分子生物学软件对Eg TSP1和TSP6基因进行生物信息学分析,预测已知序列的蛋白质抗原的结构和表位,为疫苗的研发奠定了前期基础。