巴西橡胶树产胶基因HbREF、HbHMGR1与MYCs转录因子互作

天然橡胶主要来自巴西橡胶树,巴西橡胶树是海南省主要的经济作物之一。胶乳在乳管中合成储存,乳管数量影响胶乳产量。乳管分化一直被证明与茉莉酸信号途径相关,本实验室已在前期研究中鉴定了茉莉酸信号途径中的关键转录因子MYCs与G-box顺式作用元件的互作,为了验证HbMYCs是否与含G-box(CACGTG)顺式作用元件的产胶相关基因互作,本研究克隆了两个产胶相关基因HbREF与HbHMGR1的全长启动子序列,并设计了相应的单荧光素酶报告基因实验,经生物信息学分析发现,2个基因的启动子上均含G-box (CACGTG)顺式作用元件,单荧光素酶报告基因实验的结果表明,HbREF和HbHMGR1分别与Hb MYC2、Hb MYC3、Hb MYC4互作,且受HbMYCs转录因子的正向调控,说明茉莉酸信号通路中的转录因子可以调控橡胶产排胶基因的表达,对阐明橡胶树产排胶机理具有重要意义。     

树干乙烯利处理对橡胶树叶片蔗糖代谢的影响

为增加天然橡胶产量,乙烯利被广泛使用。乙烯利刺激橡胶树能通过延长排胶时间,促进水孔蛋白的表达,增加蔗糖向乳管中转运等机制促进橡胶树树干中胶乳的生物合成。然而,乙烯利刺激树干,是否会对叶片造成影响,影响胶乳的合成,目前仍不清楚。本研究以热研8-79和热研72059一年生芽接苗为实验材料,用浓度为0%、0.6%和1.1%的乙烯利处理树干,检测叶片生理指标的变化。实验结果表明:热研8-79施用乙烯利后,胶乳产量增加,同时,叶片中叶绿素含量降低,蔗糖含量也显著降低,而果糖和葡萄糖含量升高,蔗糖合成酶活性上升,液泡转化酶和蔗糖分解合成酶活性增高。热研72059与热研8-79的结果类似,但蔗糖磷酸活性酶显著性升高,且蔗糖含量,蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性远高于热研8-79品种。研究结果表明,乙烯利刺激树干后,能改变叶片中蔗糖的代谢活动,这可能也是增加胶乳产量的机制之一。本研究以叶片为研究对象,为从源-库关系解析乙烯利刺激促进天然橡胶合成机制提供技术理论基础。     

巴西橡胶树HbRPB11基因的克隆与表达分析

橡胶树树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。生产上施用乙烯利通过延长橡胶树割胶后的排胶持续时间,调节胶乳代谢,从而达到增产的目的。但目前对于转录复合体关键成员RNA聚合酶Ⅱ在胶乳代谢过程中的动态变化尚不清楚。本研究采用RACE和RT-PCR方法,从橡胶树无性系CATAS7-33-97的胶乳中克隆到编码RNA聚合酶Ⅱ关键亚基RPB11的同源基因,命名为HbRPB11。该基因全长659 bp,包含351 bp的开放阅读框,编码一个由116个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为13.53 k D,理论等电点为5.934。实时荧光定量PCR结果表明,HbRPB11在橡胶树的多个组织中均有表达,其中在成熟叶片和胶乳中的表达量最高,并且受割胶和乙烯利处理显著上调。橡胶树不同种质间的表达模式分析显示HbRPB11基因在橡胶合成效率高的种质中的表达量要显著高于橡胶合成效率低的种质,表明该基因的表达量与橡胶合成效率呈正相关性,有可能作为生产上筛选高效合成橡胶种质材料的分子标记。     

巴西橡胶树幼叶和成熟叶比较蛋白质组学初步研究

为研究不同发育时期橡胶树叶片的功能代谢及揭示天然橡胶胶乳的合成调控机制,本研究以巴西橡胶树古铜期幼嫩叶片（幼叶）和稳定期完全成熟叶片（成熟叶）为实验材料,提取蛋白并进行双向电泳分离,结果发现幼叶与成熟叶相比,蛋白表达图谱差异显著,鉴定出的已知蛋白中多数参与了碳代谢及蛋白的翻译后修饰功能。本研究建立了成熟的巴西橡胶树叶片比较蛋白质组学研究的技术体系,获得了高分辨率的叶片蛋白双向电泳参考图谱,鉴定出来的腈裂解酶A链,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶和肌动蛋白等在幼叶和成熟叶片中的表达量不同,这些结果为进一步揭示天然橡胶合成调控机制提供了一定的技术支撑与实验数据,对天然橡胶合成机制的研究以及其它热带植物叶片的蛋白质组学研究具有一定的参考意义。     

巴西橡胶树产排胶机理的研究进展

天然橡胶是一种重要的战略性资源,巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.)是天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是高大乔木,传统育种周期特别长,基因组测序还未完成,橡胶转基因技术尚未成熟,导致橡胶突变体不易获得,这些问题较大限制了橡胶的基础研究。尽管如此,橡胶产排胶研究近年来还是取得了一定进展。本文回顾模式植物拟南芥茉莉酸和乙烯信号途径研究的最新进展,并对其进行归纳总结,概括橡胶产排胶机制研究的进展,分析当前面临的理论和技术瓶颈,并对今后研究前景做了展望。     

巴西橡胶树HbACO16基因的克隆与功能分析

天然橡胶是一种战略性工业原料,中国消费的天然橡胶严重依赖进口。外源乙烯刺激可以激活橡胶树树皮乙烯的合成并提高橡胶树胶乳产量,但是其分子机制仍不清楚。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)是植物体内乙烯生物合成途径中的关键酶,本研究从橡胶树树皮中克隆了预测的HbACO16的编码序列,通过生物信息学对其理化性质进行初步分析,该基因编码362个氨基酸,等电点为6.04,预测蛋白大小为48 kD。为了进一步验证其体外酶活性,在大肠杆菌中表达了HbACO16的重组蛋白,结果表明HbACO16重组蛋白不具有ACO酶活性。本研究为解析橡胶树内源乙烯合成中关键蛋白ACO的生理功能提供了参考。     

13份橡胶树新种质对已烯利刺激割制的生理反应

我国橡胶树新种质创新利用进展缓慢,为了深入全面的鉴定橡胶树新种质,加速其利用进程,笔者以RRIM600为对照,采用常规割和乙烯利刺激割制,对我国1986年定植于大田鉴定评价圃的13份橡胶树新种质的干胶含量、干胶产量、排胶初速度、堵塞指数、胶乳硫醇、无机磷、蔗糖及镁离子含量等生理参数进行了测定分析。结果表明：单从胶乳生理特性而言,并不能从参试种质材料中筛选出特别优良的种质供生产中直接利用,且乙烯利刺激割制下参试材料株次干胶产量均不及对照品种,但9、13号种质在乙烯利刺激割制下表现出了较好的胶乳生理状况,显示出了良好的产胶潜力。     

橡胶树皮乳管组织茉莉酸诱导相关因子AP2/EREBP基因的克隆与表达分析

摘要：茉莉酸（jasmonic acid,JA）可诱导橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）乳管分化,是乳管分化的关键信号分子。目前,对JA诱导橡胶树乳管分化的分子机理仍然不清楚。我们在前期研究中通过筛选JA刺激乳管分化时期的橡胶树树皮组织cDNA差减文库,获得了4条与茉莉酸诱导乳管分化相关的AP2/EREBP家族转录因子基因的EST。本研究在此基础上,采用RACE法完整地克隆了这4个AP2/EREBP转录因子基因的开放阅读框,蛋白氨基酸序列分析表明其中3个属于ERF亚类,1个属于RAV亚类;表达分析发现,这4个基因在乳管分化时期的橡胶树树皮组织的表达受JA诱导,随JA处理时间的延长,其表达量先增强后减弱,推测它们可能在JA诱导橡胶树乳管分化过程中起着重要的调控作用。     

不同品系橡胶树的组份及生胶性能研究

为了利于天然橡胶研发利用,利于橡胶制品选材,顺应可持续发展战略,提高天然橡胶制品经济效益,笔者研究了RRIM600、热研7-20-59、热研8813、热研7-33-97、PR107和热研8-79这6种橡胶树品系的天然橡胶鲜胶乳性能、生胶性能和混炼胶的硫化特性以及硫化胶的物理机械性能。结果表明：不同品系天然胶乳的化学成份、生胶性能存在差异;热研8-79的干胶含量最高,杂质含量最高;热研7-20-59的灰分含量、丙酮溶物含量最高;热研8-79和热研7-33-97的硫化胶所需的正硫化时间最长,而热研88-13所需的正硫化时间最短;RRIM600物理机械性能最好。     

巴西橡胶树HbbHLH1启动子的克隆与序列分析

bHLH转录因子在高等植物生长发育、激素应答和次生代谢调节中具有重要的功能.根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbbHLH1基因设计了2个特异性反向引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbbHLH1基因起始密码子上游819 bp的调控片段.序列分析表明,该片段除了含有一个典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,其中在-290 bp和-309 bp位点分别有一个应答MeJA信号反应的调控元件,但没有发现典型的乙烯响应元件.这暗示了HbbHLH1转录因子可能在橡胶树乳管分化和胶乳生物合成中具有调控作用.     

利用cDNA微阵列分离橡胶胶乳生物合成相关基因的研究

天然橡胶是我国重要的热带经济作物,关系到国计民生的重要战略物资。本研究通过对橡胶叶与胶乳mRNA的提取,及其逆转录产物cDNA经Cy3、Cy5荧光染料标记后,进行芯片杂交,杂交数据经分析结果显示,在橡胶胶乳中表达上调达显著的基因有105个, 其中表达极显著的基因有44个, 包括elongation factor Tu(延伸因子基因), thioredoxin H-type 1（硫氧还蛋白H型1基因）,4个zinc finger (C3HC4-type RING finger) family protein（锌指蛋白基因）等。在橡胶叶中表达显著的基因有151个, 其中表达极显著的有34个。研究结果对于发现橡胶胶乳表达相关基因有着重大的实践作用,对研究橡胶生物合成相关基因具有重要的参考作用,这将为研究橡胶生物合成机理奠定基础。     

巴西橡胶树乳管高效表达焦磷酸酶基因的双元表达载体的构建

以巴西橡胶树叶片为材料提取DNA,用特异引物经PCR扩增获得了378 bp的REF启动子片段,该片段序列与NCBI报道的REF序列间的同源性分别是98.68 %和99.47 %。以胶乳为材料提取总RNA,用特异引物经RT-PCR方法获得了2310 bp的V-PPase基因片段,该片段序列与NCBI报道的V-PPase基因序列一致。通过酶切和连接,将克隆的两个片段重组到植物表达载体pCAMBIA1301, pCAMBIA2301和pCAMBIA3301中,构建了分别含有潮霉素磷酸转移酶基因（hpt Ⅱ）、新霉素磷酸转移酶基因（npt Ⅱ）和抗除草剂基因（bar）的三种橡胶树乳管高效表达V-PPase基因的载体pC1301RV、pC2301RV和pC3301RV。然后用冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105,为进一步转化橡胶树奠定基础。     

橡胶树大小橡胶粒子的差速离心分离及其差异表达蛋白质的研究

为了鉴定巴西橡胶树胶乳中大小橡胶粒子之间的差异表达蛋白质以及揭示橡胶生物合成的分子机制,采用差速离心的方法,从橡胶树的新鲜胶乳中分离纯化总橡胶粒子、大橡胶粒子和小橡胶粒子,用扫描电镜和SDS-PAGE以及质谱等方法分别检测和鉴定大小橡胶粒子的分离效果及其差异表达蛋白。结果表明,大小橡胶粒子可用差速离心法得到有效的分离和纯化,它们在SDS-PAGE电泳图谱上表现出差异表达的橡胶粒子蛋白,如分子量为22.0 kDa、24.5 kDa和120 kDa蛋白等,并对其中分子量为24.5 kDa的小橡胶粒子蛋白（SRPP）进行了质谱分析。橡胶树大小橡胶粒子差速离心法的建立,为大小橡胶粒子差异表达蛋白质的分离和鉴定奠定了一定的基础,将进一步促进橡胶树橡胶粒子的起源和发育,以及橡胶生物合成分子机制的研究。     

Towards a latex molecular diagnostic of yield potential and the genetic engineering of the rubber tree

The latex from Hevea brasiliensis is expelled from specialized cells upon bark tapping. The latex yield is mainly limited by the duration of the latex flow, which is controlled by coagulation processes. Bark treatment with ethylene is known to delay coagulation and increase latex yield. The molecular basis of latex coagulation has been characterized: (1) Hevein, a lectin-like protein, induces latex coagulation by bringing together the rubber particles (RPs). The hevein-RPs bridging is mediated by N-Acetyl-D-glucosamine, and involves a 22 kDa receptor glycoprotein localized on the RPs surface. This process is inhibited by the removal of the sugar moiety from the receptor, through the action of N-acetyl-glucosaminidase and chitinases. (2) Ethylene induces, in the latex cells, an over-expression of the 3 genes coding for hevein and its receptor, and a chitinase. The higher over-expression of one chitinase can explain the partial deglycosylation of the hevein receptor and the resulting delay in coagulation. (3) The level of hevein and chitinase expression in the latex is a clonal characteristic, linked to the characteristics of the latex flow. Expression of these genes might be used as molecular markers for high yield potential. Based on these findings, it would be interesting to improve the rubber tree through the genetic engineering technics, to get new high yielding cultivars with prolonged latex flow. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

割胶制度对天然橡胶成份及橡胶性能影响的研究进展

概述了国内外割胶制度,介绍了不同割胶制度对橡胶树生理、胶乳非胶成份、胶乳浓度、橡胶胶乳 胶体性能及胶乳胶膜性能的影响,对比分析了低频新割制与高频旧割制的特点,对割胶制度改革的推进 具有一定的指导意义。     

橡胶树砧穗胶乳养分含量与产量的关系

为探讨橡胶树高产的机理,分析了不同产量水平橡胶树(PB86)砧木和接穗胶乳养分含量的差异。通过对干含、总固形物、硫醇、糖、无机磷、粗蛋白等的比较分析,结果表明,（1）橡胶树自身的砧木与接穗之间,除超高产橡胶树砧木中蔗糖、硫醇的含量极显著高于接穗外,其他养分含量在超高产、高产橡胶树自身的砧木与接穗之间差异并不显著,但一般单株橡胶树接穗胶乳中干胶含量、总固形物含量均极显著高于自身砧木。（2）不同产量水平的橡胶树之间,产量越高的橡胶树其砧木胶乳中各种养分的含量也越高,超高产橡胶树砧木中干含、总固形物、硫醇、糖的含量均极显著高于高产树和一般单株。（3）不同产量水平橡胶树接穗间硫醇、蔗糖、粗蛋白的含量差异均未达极显著水平。相对而言,与嫁接后橡胶树砧木与接穗之间的营养物质运输对橡胶树产量的影响相比,嫁接时优良砧木材料的选择更为重要。     

橡胶人工林的水文生态效应

针对社会上对橡胶人工林水文生态效应的质疑,对橡胶树人工林的水文生态效应的研究结果进行了综述。结果表明,橡胶树是种重要的林业和经济树种,橡胶林与天然林相似具有良好的水文生态功能,只要严格按照《橡胶树栽培技术规程》植胶,就能得到良好的社会经济和生态效益。