植物突变体库的作用及构建研究进展

发生突变的个体叫作突变体。突变体往往具有与野生型不同的表型,这样就为缺失组分的功能研究提供了有益的信息。主要介绍了植物突变体库的作用及构建方法,重点论述了自发突变体库、理化诱变突变体库及T-DNA插入突变体库的构建原理与特征,并对植物突变体库的研究前景进行了展望。     

水稻重要性状基因的克隆与功能研究取得重要成果

水稻是第一大粮食作物,在国民经济中占有举足轻重的地位,随着基因组测序的完成,水稻基因组研究已由结构基因组研究转向功能基因组时代,其中,突变体库构建是水稻功能基因组学研究的重要基础。由西南大学何光华教授牵头的重庆市首届杰出青年基金研究团队,利用突变体库在水稻重要性状基因的克隆与功能研究上取得了一系列重要研究成果。该团队克隆并系统研究了雄蕊雌蕊化基因SL1、嵌合花器官基因CFO1、叶片卷曲基因RL14、     

花生突变体创造途径及进展综述

花生是中国重要的油料作物之一,丰富的种质资源是花生遗传育种和功能基因组学研究的重要基础,通过理化因素诱发构建突变体库的方法已成为创建新型种质资源的一种有效手段。本研究阐述了构建花生突变体库的目的和意义,综述了诱变技术在创造花生突变体和品种改良中的应用,并展望了突变体库在花生功能基因组学和分子标记辅助育种中的前景。     

水稻突变群体的构建及功能基因组学

随着水稻基因组全序列的测定完成，功能基因组学已成为重点研究内容。功能基因组学主要研究生物有机体内各基因的生物学功能进而了解所有基因如何协调发挥作用完成一系列的生长发育过程。目前已经发展了多种分析鉴定基因功能的方法，其中最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因功能。本文主要阐述了各种构建方法及其优缺点以及在功能基因分离鉴定上的应用。自发突变的频率极低，且自发突变基因的分离难度比较大，只能作为突变群体构建的辅助方法。利用EMS等化学诱变剂可以在短时间内构建大量点突变群体，并可用TILLING进行突变检测，但多位点的点突变使突变表型难以鉴定。由快中子等物理诱变也可以在短时间内构建大量缺失突变体，且可用Ddeteagene系统进行检测；但多基因缺失、多位点缺失和内含子缺失等使突变表型的分析可能无法进行。利用T—DNA、转座子和反转录转座子等构建插入突变体已经成为突变库构建的主要方法。T—DNA插入已成功应用于水稻大规模突变体的构建，但只限于转基因效率较高的品种；T—DNA在基因组中整合的复杂性以及转基因过程中由组织培养等引发的突变等，增加了突变体表型和分子分析的难度。Tos17是目前应用最为成功的反转录转座子，但多拷贝的插入使突变体的表型鉴定和分子鉴定较为困难，因为只有10％左右的突变性状是由Tos17插入引起的。理论上，Ac／Ds双因子系统是目前最理想的水稻插入突变库构建体系，Ds的单拷贝插入，大大方便了突变体的表型分析和分子鉴定；Ds的回复突变，可以验证突变表型是否由Ds插入引起；但在血转座酶驱动下Ds可能发生的多次跳动所形成的痕迹(footprint)也可能影响突变表型的分析。RNAi可以有效地使目标基因沉默，但并不是所有基因均可被RNAi沉默；对多因一效基因或同源性较高的基因家族，RNAi会同时作用这些基因，沉默表型很难鉴定。可见，每一种方法都有各自的优缺点，但不同的方法是可以互补的，通过各种方法是能够构建成理想的水稻突变库的。     

水稻叶色突变体研究进展

光合作用是水稻生长发育的生理基础,叶片是水稻进行光能转化的主要组织,水稻叶色突变在一定程度上间接影响水稻产量。创制水稻新的叶色突变体,解析其基因突变的分子机制对水稻的功能基因组学研究和杂交水稻育种具有重要意义。本研究从已定位和克隆的部分叶色基因综述了水稻叶色突变体分类、产生、基因突变的分子机制(包括叶绿素合成与代谢途径,叶绿体发育途径以及其他途径)、水稻叶色突变体的应用与展望,并归纳了部分叶色基因在突变体中的表达情况,将有助于研究水稻光合作用途径和机制。     

全世界共200000份水稻突变体可供科学研究

全世界科学家们正在建立转基因水稻库，目的在于理解组成水稻基因组的57000个基因的功能。国际水稻功能基因组协会最近公布大约有200000份水稻突变体株系可以利用，这些突变基因覆盖了水稻图谱中近一半的已知功能基因。     

水稻抗病防御反应分子机制研究取得新进展

<正>中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室储成才课题组和中国水稻所水稻生物学国家重点实验室朱旭东课题组合作,通过对不同水稻突变体库进行大规模筛选,获得两个不完全显性、叶鞘特异性自主坏死的突变体n1s1-1D和n1s1-2D。研究表明,NLS1的功能获得性突变导致了突变体特定     

3种基因突变方法在微生物中的应用研究进展

为了解某个基因的功能,最常用的方法就是构建该基因缺失的突变体,通过测定突变体的某些性状来分析该基因的功能,因此,获得由基因型决定的表型突变体在生物学研究中极为重要。本研究主要介绍了3种构建基因突变体的方法:转座子插入突变、同源重组和定点突变技术,转座子插入方法多用于构建突变体库,同源重组多用于基因功能的研究,定点突变多用于蛋白质功能的研究。3种方法各自侧重点不同,将同源重组和定点突变技术结合起来是将来研究基因突变的一个方向。最后,论述了基因突变技术存在的缺陷和不足,提出该技术还亟待完善。     

全基因组基因嵌入突变体库用于发掘野生稻有用基因及超级杂交稻分子育种的策略

纵观水稻育种的历程,每一次新突破都离不开新技术的利用和新遗传种质资源的发掘.超级杂交稻在达到第二期12 000kg/hm^2的目标后,进一步挖掘产量潜力实现13 500kg/hm^2的第三期目标需要基因资源创新和分子育种技术的加盟.利用可转化大片断基因组文库和基因嵌入突变体库是发掘野生稻有利基因的新策略,它包括构建野生稻可转化大片断基因组文库,通过转基因技术,将大片段克隆导入栽培稻中,建立全基因组基因嵌入突变体库.在构建突变体库前可根据保守序列、分子标记等对大片段克隆进行筛选,减少需要鉴定的大片段克隆数量,并可利用遗传转化效率高的模式植物拟南芥来进行大片段克隆初步鉴定,避开水稻转化效率仍然不高这个瓶颈.然后通过突变体田间鉴定,筛选出抗寒、抗虫、抗病、高产等突变体材料并应用到超级杂交稻育种中;同时对控制突变性状的大片段克隆进行亚克隆、功能补偿分析和序列分析,最终克隆野生稻有利基因.这一技术也适用于发掘和克隆其他植物基因.     

水稻几个披垂叶突变体的表型研究及其遗传分析

随着水稻功能基因组学的发展,水稻突变体已成为研究相关基因功能与表达的良好实验材料。同时,水稻突变体还可以为当今水稻常规育种和分子育种提供新的种质资源。本文主要阐述了几个水稻披垂叶突变体在株型、株高、穗粒数、结实率、千粒重等方面的特征特性,并分析了它们在与正常植株杂交后F1、F2群体表现。研究表明,突变体与野生型正常植株杂交的F1代在经济学性状和生物学性状上均表现出超亲优势,而在F2群体中表现出有规则的分离,3个突变体中披垂叶性状均为隐性基因控制。在突变体材料MR304中,控制披垂性状的为2对隐性基因,其中1对为主效基因。在突变体材料MR168和MR312中,控制披垂性状的均为单隐性基因。     

水稻穗大小决定基因PS1的遗传分析及克隆

穗大小是影响水稻产量的重要农艺性状之一。本研究在水稻粳稻品种"中花11号"T-DNA插入突变体库中鉴定了一个植株略矮、穗长变短25%、一次枝梗和二次枝梗数目分别减少33%和80%、且粒型变异的突变体。T-DNA标签共分离检测表明:该突变体的表型与T-DNA插入无关。通过与籼稻品种"珍汕97"配置杂交组合构建遗传作图群体,F2杂合后代符合经典孟德尔遗传分离比3:1,证明突变性状受一对隐性基因PS1(Panicle Size 1)所控制。采用图位克隆的方法,将基因PS1初步定位在第11号染色体短臂上的IN44和IN50标记之间,两标记物理图距为105 kb。对候选基因进行进一步的表达量分析、比较扩增及测序发现基因LOC_Os11g12740(即SP1)可能是本研究的PS1基因。本研究为进一步分离克隆PS1基因及对水稻穗大小发育的深入研究提供依据。     

一个水稻温敏黄化突变体的表型分析和基因定位

对水稻叶色进行表型分析与基因定位,可为图位克隆该类基因和研究水稻光合系统功能奠定基础。利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)诱变的方法,从籼稻品种"南京11"(简称NJ11)中获得温敏黄化突变体dy1;与野生型相比,dy1在自然环境下,从苗期至成熟期始终表现叶片黄化,透射电镜显示dy1类囊体结构异常;同时株高、分蘖数、结实率等农艺性状也表现出极显著的差异;实验室光照培养箱条件下,dy1苗期在20℃下表现白化,在25℃表现黄化,在30℃下为浅绿的表型;遗传分析表明水稻温敏黄化突变体dy1的表型是由1对隐性基因控制;将突变体与粳稻广亲和品"02428"杂交,构建F2群体,从中选出隐性极端个体,通过基因定位,将控制黄化的基因限定在第1染色体长臂上标记Y-4和Y-35之间的115 kb的区间内,含有16个开放阅读框(ORF),测序发现,dy1中编码尿嘧啶核苷酸激酶的基因LOC_Os01g73450的第4个内含子与第5个外显子交界处存在单碱基替换,拟作为候选基因;且叶绿体合成相关基因表达量显著降低,猜测该基因可能参与了叶绿素合成途径。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻miR1866突变体构建

microRNA(miRNA)是长度为18~25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR1866的研究还比较少。本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突变体,挖掘水稻miR1866的功能。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了miR1866的突变靶点,通过人工合成的方法得到包含突变靶点的特异序列,经过磷酸化修饰和退火后与载体Sg RNA连接进而与Cas9重组得到miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,结合测序结果判断转基因植株突变单株的突变基因型。本研究比较了野生型和突变体(KO1866-1-2和KO1866-2-4)在相同培养条件下苗期的根长、株高、茎基粗、鲜重和干重,结果表明:在营养液培养条件下,突变体的株高、根长、茎基粗、鲜重和干重均显著低于野生型。据此推测,miR1866对水稻的生长发育有一定的调节作用。本研究利用CRISPR/Cas9创制水稻miR1866的突变体,对研究miRNA调控途径,完善水稻miRNA调控的分子机制具有重要的意义。     

一个新的水稻短根毛突变体的遗传分析和基因定位

根毛是植物吸收水分和养分的重要器官。本研究从T-DNA突变体库中获得一个以中花11为遗传背景的水稻短根毛突变体, 命名为ossrh3 (Oryza sativa short root hair 3)。该突变体的根毛伸长严重受阻, 并且伴随株高、主根长、侧根长和侧根数目等性状的改变。遗传分析表明该突变性状受1对隐性单基因控制, 利用ossrh3纯合体和籼稻品种Kasalath杂交构建F₂定位群体, 利用已公布的水稻SSR (simple sequence repeat)和自行设计的STS (sequence- tagged site)标记, 最终将OsSRH3定位在水稻第1染色体上的标记S38978和S39016之间, 物理距离约为37.7 kb, 包含8个候选基因, 为进一步克隆OsSRH3基因和研究禾本科作物根毛发育的分子调控机理提供了依据。     

水稻Ds插入双分蘖突变体形成机理的分析

在水稻Ds插入突变株筛选过程中，发现一个在同一分蘖节形成大、小两个分蘖的双分蘖突变体dt1（double tillers mutant），两个分蘖均可正常抽穗形成有效分蘖。采用TAIL-PCR技术从该突变体中克隆了Ds插入的侧翼序列，将该序列作为查询序列进行核苷酸序列数据库（NCBI-BLAST）在线比对分析，发现所克隆的Ds侧翼序列与3号染色体的克隆OJ1345H02（gi|21281466）序列同一性达100%。以FGENESH和GeneMark.hmm两种软件分别对Ds插入基因的结构进行分析，在外显子的数目、大小、位置等方面均得出高度一致的结果。同时，用NCBI Entrez server和Pfam等软件对该基因进行功能预测，推测的基因编码产物含保守的FH2结构域，为水稻类形成素蛋白。突变体后代Ds插入基因型分析显示，其后代出现分离，表明该突变体为Ds插入杂合体。     

长雄野生稻(Oryza longistaminata)全基因组Fosmid文库构建

长雄野生稻(O.longistaminata)起源于非洲,具有和亚洲栽培稻相同的AA基因组,是栽培稻改良的重要遗传资源。本研究构建了长雄野生稻全基因组fosmid文库,共获得33.6万克隆,文库的平均插入片段大小约为40kb,其中94.7%的克隆插入片段大小在30~50kb之间。挑取其中约11万克隆并保存,可覆盖10倍栽培稻基因组,对任意基因或序列的筛选概率达到了99.99%。将剩余的22万个克隆进行了末端配对测序,显示其有助于长雄野生稻全基因组测序的拼接。所构建的fosmid文库为筛选和克隆长雄野生稻的有利基因提供了研究材料。     

籼稻品种H359基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建

村建能够通过农杆菌介导转化植物的人工染色体文库可以加快突变基因的精细定位和克隆的速度。为了克隆水稻突变基因的需要，我们利用pYLTAC7载体构建了籼稻品种H359基因组的TAC文库。该文库包含41088个克隆，保存在107块384孔板中。插入片段大小在50—100kb之间，平均插入大小为77kb，推测该库覆盖水稻基因组接近7．4倍。     

全长cDNA文库的构建方法

全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径，克服了传统cDNA文库的缺点，节省了基因克隆和功能鉴定的时间，促进了功能基因组的研究进程。目前有6种构建全长cDNA文库的方法，包括Oligo-Capping、CAPture、SMART、CAP-trapper、CapSelect、CAP-jumping。这几种方法在起始材料用量、文库构建技术、实验操作复杂程度和文库构建质量等方面构存在不同程度的优缺点，但综合比较而言，SMART和CAP-trapper这两种方法比较有实际应用价值。SMART法适于简单、快速地构建一般质量的cDNA文库，如果采用Little-cycle SMART和Large-size SMART这两种改进技术，所建文库质量也非常好；CAP-trapper法虽然对实验技术要求较高，实验过程复杂，但所建文库全长率高，冗余性低，建库效率高，是目前构建高质量文库最好的方法。     

红莲型水稻不育系和保持系线粒体基因组BAC文库的构建

以红莲型(HL)细胞质雄性不育系和保持系为材料, 构建了水稻线粒体基因组的BAC文库. 每个文库保存约2300个菌落, 外源插入片段介于9～25 kb之间. 以线粒体基因为探针对文库进行菌落原位杂交验证, 均筛选到了阳性克隆. 构建的两个文库为进一步研究水稻线粒体基因组的结构特点, 为克隆与红莲型水稻细胞质雄性不育相关的线粒体基