马尾松转录组SSR序列特征分析及其分子标记开发

为了开发马尾松SSR标记,本研究利用MISA软件对马尾松转录组测序获得的148 186条Unigene (序列总长约91 449.7 kb)进行全面分析,共搜索获得6 611个SSR位点,分布在6 003条Unigene上,SSR发生频率为4.05%,平均每13.83 kb出现1个SSR,结果发现单核苷酸重复出现的频率占总SSR的53.60%;二核苷酸为23.46%;三核苷酸为21.33%。通过对含SSR的Unigene的GO分析,显示生物过程包含的Unigene占40.60%;细胞组分包含的Unigene占35.45%,分子功能包含的Unigene占23.95%;转录组中有724个Unigene可被注释到110个KEGG通路中,其中被注释到新陈代谢的Unigene最多有312个,其次是遗传信息处理类有183个。根据含SSR的Unigene序列共设计了4 247对SSR引物,并随机挑选30对SSR引物进行PCR扩增验证,其中12对引物能够扩增出目标条带,引物的有效性为40%。本研究结果表明,马尾松转录组测序获得的Unigene序列可作为SSR标记开发的有效来源,所开发的SSR标记为马尾松的遗传图谱构建、分子标记辅助育种等研究提供丰富可靠的标记。     

基于高通量测序的大花序桉顶芽转录组生物信息学分析

为了获得珍贵用材树种大花序桉顶芽转录组数据及预测关键基因功能,本研究基于Illumina HiSeq X Ten测序技术获得大花序桉顶芽转录组原始数据,经Trinity组装拼接获得高质量Unigene,并与NR、Swiss-Prot、GO、KOG、egg NOG和KEGG等生物信息数据库进行序列比对和功能注释,利用MISA软件进行SSR位点搜索和分析。从大花序桉顶芽中共获得26 587条高质量Unigene,平均长度为1 279.69 bp;共有22 099条Unigene至少在一个数据库中被成功注释,其中,11 507条Unigene被注释到KOG数据库中25个功能类别,以参与一般功能基因的数量最多;GO数据库中,所注释到的14 105条Unigene分别匹配到生物功能、细胞组分和分子功能3大类50个功能基因区,其中执行生物过程所占比例最多;KEGG功能注释共发现有7 117个Unigene参与127条代谢通路,以代谢相关的基因最丰富;共有1 021条Unigene注释到转录因子数据库,分布于65个家族,其中比例最大的是bHLH和MYB家族;3 274条Unigene注释到植物抗性基因数据库,分布于13个类别,相匹配基因数量最大的是RLP和TNL。MISA软件共检测到12 366个SSR位点,分布密度为1/2.75 kb,重复基元类型丰富,标记开发潜力大。本研究利用高通量测序获得丰富的顶芽转录组信息,可以为大花序桉分子辅助育种提供丰富的资源。     

基于高通量测序的天目铁木转录组分析

天目铁木为中国特有的珍稀濒危植物,5株原生株分布在浙江西天目山。随着环境条件的不断恶化,对濒危植物的保护变得尤为重要,从20世纪80年代初开始对天目铁木开展研究,然而到目前为止对于天目铁木分子生物学和基因功能方面的研究仍旧较少。为了获得天目铁木的基因数据和初步了解基因功能,本研究利用Illumina Hiseq高通量测序平台对天目铁木转录组进行测序,经Trinity软件组装得到58386条Unigene。利用BLAST软件将得到的Unigene与Nr、Swiss-Prot、Go等7大公共数据库进行同源比对。最终有36884条Unigene获得注释。另外利用MISA软件对所得到的Unigene进行SSR位点的发掘,共得到7670个SSR位点。利用高通量测序技术获得的天目铁木转录组信息将为后续该物种功能基因、基因表达、SSR分子标记等研究打下基础,同时能更好地指导天目铁木的保护、遗传多样性研究以及扩繁工作等。     

外源因子处理下蓝莓不同发育阶段果实的转录组分析

采用Illumina测序技术对在醋酸钙、硫酸铵和蔗糖处理后蓝莓不同发育阶段的果实进行转录组测序,获得Clean Reads 2723731442条,经组装得到平均长度为753.65 nt的87608条Unigene。将转录组Unigene进行基因功能注释,其中39867条Unigene能被NR数据库注释,与葡萄同源序列最多,占8.58%;与GO数据库比对发现,有29661条Unigene获得注释,分别匹配到生物过程、细胞组成和分子功能三大类共59个分支;与KOG数据库进行比对,发现有21992条Unigene具有功能信息,分别涉及25类;根据KEGG数据库的注释信息进行Pathway注释,参与的代谢通路共有246条;共检测到8704个SSR位点,其中双碱基重复的SSR占78.57%。本研究为探索外源物质调控蓝莓果实生长发育、生理代谢的分子机理提供了理论基础。     

基于转录组测序的黑枣EST-SSR引物开发与鉴定分析

目前黑枣已有的分子标记比较匮乏,本研究基于转录组测序技术对黑枣品种进行SSR引物开发,为黑枣种质资源评价及分子标记辅助育种提供有力的技术支持。本研究对‘冀洪1号’黑枣转录组序列进行了分析筛选和开发,并利用开发出的引物进行了验证分析。结果表明:共得到52 537个Unigene序列,SSR位点总数22 327个,包含SSR的Unigene序列数为15 286条。黑枣SSR位点的重复单元中,二核苷酸重复类型的SSR最多(52.26%),其次为单核苷酸(25.84%)及三核苷酸(19.25%)。随机挑选90对EST-SSR引物进行验证,有效扩增率为77.78%(70对),多态性引物比例为18.57%(13对),对13个多态性位点进一步分析可得,共扩增了35个等位基因,PIC值介于0.233~0.677之间,平均为0.430。本研究开发出的EST-SSR分子标记,为后期进行黑枣良种的鉴别及分子育种提供了分子技术手段。     

苦荞种皮转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发

为开发苦荞新的SSR标记,本研究利用MISA软件对苦荞种皮转录组测序数据进行SSR位点信息搜索,利用Primer 3设计引物并随机选择53对引物进行验证。结果表明:苦荞种皮转录组数据库中共搜索到9 094个SSR位点,其中,单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重复类型占优势,占总SSR的63.99%、19.35%、15.49%;共发现70种重复基元,其中A/T、AT/AT、AAG/CTT基元是优势基元。设计合成的53对引物中,41对引物(77.36%)获得有效扩增,21对引物具有多态性。本研究从转录组序列中大规模开发的SSR分子标记将有助于苦荞遗传多样性与分子育种研究。     

基于苦瓜转录组序列的SSR分子标记开发

为了全面了解苦瓜转录组SSR位点特征和满足苦瓜分子育种对分子标记的需求,利用MISA软件对来自苦瓜材料‘大沥-11’6个组织的59740条转录组Unigene序列进行SSR位点搜索,共检测出31066个SSR位点,出现频率(发现的SSR个数与总Unigene数之比)为52.00%,平均每2.62 kb出现1个SSR位点。在苦瓜转录组SSR位点中,基元类型主要为三核苷酸,占总SSR位点的42.17%;其次是二核苷酸,占总SSR位点的31.66%。利用Primer 3软件对搜索到的苦瓜转录组SSR位点进行引物设计,然后把获得的引物序列比对回苦瓜的参考基因组,选择上下游引物序列都是唯一比对的序列并去除重复后共获得9135对特异SSR引物。选择MC00上的232对特异SSR引物对‘谭边大顶’和‘华艺320’两个苦瓜品种基因组DNA进行PCR扩增,其中有219对特异引物可扩增出清晰的条带,有效扩增率为94.40%;有31对特异引物扩增产物表现出多态性,多态率为13.36%。本研究开发的苦瓜转录组特异SSR引物为苦瓜的种质资源分析、基因定位、分子标记辅助选择等理论与应用研究提供了引物数据参考。     

蓝莓花粉转录组SSR位点信息分析

基于‘灿烂’、‘顶峰’、‘蒂芙蓝’、‘杰兔’和‘园蓝’5个兔眼蓝莓花粉转录组数据,开展SSR信息分析及引物设计,为开展蓝莓的基因定位及花粉直感效应形成的分子机制等研究提供理论依据。本研究采用MIcroSAtellite (MISA)和Blast2GO对无冗余Unigene进行SSR筛选、识别及富集分析,采用Primer 3进行SSR引物设计。在58 985个Unigene中有15 407个Unigene含有20 812个SSR位点,发生频率为35.28%。SSR的主要重复类型为单核苷酸(54.24%)和二核苷酸(33.78%),两者分别以A/T (53.91%)和AG/CT (28.37%)基元占绝对优势。基因GO功能分类表明,含有SSR位点的15 407个Unigene被富集到3个Ontology类别的50个GO Term中,其中涉及代谢、细胞和单机体的生物过程的GO Term最多。成功设计16 854对SSR序列引物,成功率为80.98%。从蓝莓花粉转录组基因序列中成功筛选了具有良好多态性潜能的SSR位点并开发了引物,可为蓝莓的分子标记辅助育种、遗传多样性及花粉直感效应形成的分子机制等研究提供分子标记基础。     

基于RNA-seq牡丹SSR标记开发及通用性分析

从牡丹花色候选基因中开发一套SSR标记,为牡丹花色分子遗传学研究和分子标记辅助育种提供帮助。本研究基于高通量转录组测序技术(RNA-seq)获得了278条涉及调控牡丹花色形成的Unigenes序列,利用SSRIT在128条Unigenes中检测到215个SSR位点,出现频率为46.04%。其中优势重复基序为二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复,分别占总SSR位点的18.60%、41.86%和36.28%,优势重复基元为TC/GA和AT/TA,分别占二核苷酸重复的30.00%和27.50%。在此基础上,从中选择100对SSR引物合成,以牡丹品种基因组DNA为模板,验证其有效性和多态性。结果表明,有效引物50对(占50%),多态性引物12对(占24%)。12对多态性引物在芍药属12个不同种质内进行通用性检测,转移率范围为83.33%~100%,平均转移率为96.53%,表明牡丹SSR标记在芍药属内具有较高的通用性。利用高通量RNA-seq开发牡丹候选基因SSR标记可为牡丹功能基因挖掘、品种分子身份证构建、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供重要的遗传资源。     

六种新疆特色梨果的转录组分析

梨是新疆地区栽培面积和产量较大、品种资源丰富的一类特色果树,具有重要的产业地位。为促进新疆特色梨从传统育种向现代育种方式发展,迫切需要开展功能基因的挖掘。本研究以轮台句句梨、南果梨、香梨、鸭梨、圆黄、红茄等6种新疆特色梨果为材料,进行了无参转录组学分析,获得1021868070条高质量Clean read数据,总碱基数为152530521446 bp。Clean read经De novo组装后获得78827条Unigene。采用六大公共数据库作同源比对,注释到50542个Unigene。对Unigene作GO和KEGG功能分类,获得49个功能群和130个通路,确定了绿原酸合成途径的部分候选基因,并检测到17416个SSR位点。本研究为新疆特色梨果功能成分绿原酸合成分子机理研究和遗传多样性分析提供了科学依据。     

山东栒子全长转录组测序数据组装及功能注释

山东栒子是中国山东省的特有种,现已处于极度濒危状态。目前,山东栒子的分子生物学研究较少,基因数据库资源极度缺乏,急需探究其生物学遗传信息,以加快对山东栒子的保护遗传学工作。本研究以山东栒子叶片、花、成熟果实为实验材料,利用PacBio Sequel测序平台对其转录组进行全长转录组测序。共得到高质量去冗余的转录本53932个,作为最终转录本序列。预测到的CDS区共52490个;对其SSR位点进行分析,对测序得到Unigenes进行单核苷酸至六核苷酸重复的SSR位点搜索,共搜索到26796个SSR位点。对非冗余转录本利用BLAST软件与NR、Swissprot、GO、COG、KOG、KEGG 6个数据库进行比对,一共成功注释了53319个Unigenes,其中与NR数据库进行比对中注释为苹果的的相关基因数量最多,其次是白梨和桃;在GO数据库中有33305条山东栒子Unigenes被注释分类,由生物学过程、细胞成分和分子功能三部分组成;在与COG数据库比对中,共有23910条比对到了同源序列,且一共被分为25类;在与KEGG数据库的一系列比对中,可将Unigenes映射到126条代谢通路中。本研究在高通量全长转录组水平对山东栒子进行了系统研究,这为进一步开展山东栒子的分子标记开发和挖掘优良基因提供了科学依据,从而推动山东栒子的保护与利用。     

基于高通量测序技术的杭白芷(Angelica dahurica)根转录组数据分析

为获得杭白芷转录组信息特征,本研究利用Illumina HiSeqⅩTen测序平台对杭白芷根进行高通量转录组测序,获得高质量序列(Clean reads)47742445条,Trinity denovo组装后得到47044条Unigenes,平均长度1164.20 nt。BLAST分析显示分别有32208(68.46%)、23049(48.99%)、10479(22.27%)、17883(38.01%)、28201(59.95%)、20731(44.07%)、55(0.12%)条Unigenes在数据库NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、eggNOG、GO、Pfam中获得注释,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类57分支,涉及205个KEGG代谢通路,其中包括27个次生代谢通路。蛋白编码框序列32303个,高等植物转录因子58个家族,借助MISA软件发现10020个SSR,其中二碱基重复最丰富,有4336个,出现频率为43.27%;五碱基重复SSR最少仅占0.37%。本研究获得了大量基因序列信息以及SSR信息,为今后开展相关分子机制研究提供了数据资源和理论基础。     

贵州山核桃转录组文库构建与测序

为探讨贵州山核桃(Carya cathayensis Sarg.)转录组功能基因信息,首次使用Illumina Hiseq 2500平台对贵州山核桃进行转录组测序分析,共获得43241968个reads片段。经序列组装共计获得98117条unigene,总长度高达80841463 bp,74.22%的unigene长度集中在1~1000 bp之间。功能注释结果显示,有58464个unigene在NR数据库获得注释,注释到葡萄科的占总的unigene 28.7%。另外对获得注释的序列信息进行初步分析,选取生物学特征重要基因(生长相关基因)和油脂合成相关基因进行初步筛查,分别获得15个和16个基因,填补了贵州山核桃转录组功能基因信息空白,为进一步开展贵州山核桃重要品质基因挖掘和功能标记开发奠定了重要的分子基础。     

濒危珍稀植物半枫荷转录组中SSR位点分析

分析半枫荷转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为半枫荷EST-SSR分子标记提供有力工具。利用MISA工具筛选了半枫荷转录组测序获得的77629条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer 3.0设计SSR引物,并随机选择50对SSR引物对4株不同来源的半枫荷进行多态性扩增分析。在半枫荷的转录组中,共找到15041个SSRs,分布于10669条Unigenes,SSR位点发生频率为13.74%,含多个位点的序列数为3114,占SSRs位点总数的29.19%,以复合形式出现的位点数2044个,占SSRs位点总数的19.16%,SSRs的平均距离是3.2 kb。SSRs位点中二碱基重复是主要类型,占总SSRs的42.17%;其次是单碱基重复基序(38.25%)SSRs。所包含的重复基元中,单碱基重复基元A/T(5572),二碱基重复基元AG/CT(4845)是优势重复基元类型,分别占总SSRs的37.05%、32.21%。利用Primer 3共设计出28590对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中44对(88.0%)扩增出清晰、可重复的条带,15对(34.1%)扩增条带表现出多态性。半枫荷转录组SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析、分子标记辅助育种和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

亚麻(Linum usitatissimum)铅胁迫转录组初步分析

亚麻的不同器官具有多种商业价值。随着土壤重金属污染情况日益加剧,有必要对亚麻响应重金属污染的分子机理进行研究。本研究采用二代测序技术,对亚麻在铅胁迫下地上部位样品进行转录组分析。通过对原始测序数据进行质量控制,并利用HISAT软件等对处理后数据拼接到亚麻参考基因组,获得了高质量Unigenes和拼接结果。对Unigenes进行序列比对、功能注释和分类、序列变异分析。结果显示,本次测序结果共获得43471条Unigene,并且这些Unigenes的大部分(89.6%)都完全比对到参考基因组的预测外显子区域。对测序结果的KOG和KEGG分析结果表明亚麻在铅胁迫条件下可能影响的通路信息。最后,对测序结果进行转录因子预测和序列变异分析,为后续针对亚麻响应重金属胁迫的相关研究提供了候选分子资源。     

盐胁迫对罗布麻种子萌发及生理特性的影响

以引种于内蒙古农业大学农场的巴盟（巴彦淖尔盟）、包头、通辽地区的栽培罗布麻种子为供试材料,研究了0（CK）、100、200、300、400mmol/L NaCl 5个盐浓度胁迫对罗布麻种子萌发及生理特性的影响,比较其耐盐性,并采用盐害指数、盐害级别与隶属函数法对其耐盐性进行综合评价。结果表明：在0~400mmol/L NaCl范围内,巴盟、包头、通辽地区罗布麻种子随着盐胁迫程度的增加,发芽率、发芽指数和活力指数显著降低;丙二醛（MDA）含量均随着盐浓度的增加呈上升的趋势,而3个地区材料的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、脯氨酸和可溶性糖的含量均随着盐浓度的增加呈现先上升后下降的趋势。同时发现,NaCl浓度低于200mmol/L时,对罗布麻种子萌发影响不明显;采用盐害指数、盐害级别和模糊数学中的隶属函数法对3个地区罗布麻种子萌发过程的抗盐性强弱进行评估,抗盐性大小表现为：巴盟罗布麻>包头罗布麻>通辽罗布麻。     

基于桑葚转录组测序的SSR位点分析

采用转录组测序技术对三个时期的桑葚进行转录组测序,建立桑葚的EST数据库。基于生物信息学方法分析桑葚转录组数据库的简单重复序列位点。从51895条Unigenes中共检索出23641条Unigenes含有44867个简单重复序列位点,共计252种基序类型。在所有基序类型中,以A/T与AT/AT型出现次数最多。单核苷酸基序类型与二核苷酸基序类型出现频率最高,共计75.69%。基序长度以10~20 bp为主,重复次数集中5~18次。设计27149对引物,随机选择20对引物,通过PCR验证,在4个桑树品种中展现出良好的重现性与通用性。桑葚转录组SSR位点类型丰富,具备开发出适宜于果桑选育的分子标记的潜力。