植物抗寒工程中脂肪酸去饱和酶研究进展

低温是影响植物生长的重要因素之一。本文介绍了多不饱和脂肪酸与植物抗寒性的正相关关系,并从脂酰-ACP去饱和酶、脂酰-CoA去饱和酶、脂酰-脂去饱和酶等几个方面综述了近几年里与植物抗寒性相关的脂肪酸去饱和酶基因的克隆、功能鉴定、表达调控等方面的研究进展。也讨论了一些对不饱和脂肪酸和植物耐低温间因果关系存在争议的研究报道。展望了应用基因工程技术培育出抗寒抗冻性较强的林业木材品种。     

胡麻脂肪酸去饱和酶基因(fads)差异表达分析

为了了解fad基因在胡麻蒴果发育过程中对不饱和脂肪酸的调控,对高、中、低三个不同亚麻酸(C18:3)含量的胡麻品种(’CDC Gold’,‘内亚7号’,’Linola’)进行了不同时期的品质测定,以及脂肪酸去饱和酶2a基因(fad2a)、脂肪酸去饱和酶2b基因(fad2b)、脂肪酸去饱和酶2c基因(fad2c)、脂肪酸去饱和酶3a基因(fad3a)、脂肪酸去饱和酶3b基因(fad3b)的qRT-PCR定量分析。结果表明,随着蒴果成熟,可溶性糖含量呈降低趋势,粗脂肪与粗蛋白不断积累,且差异显著(p<0.05)。fad2a基因、fad3a基因以及fad3b基因在各个时期中的表达符合正态分布。以0 d的蒴果为对照,在胡麻种子形成过程中,‘内亚7号’的三个基因在5 d和15 d的表达量迅速增加,到30 d时急剧减少,15 d的fad2a基因表达量为5.23倍,fad3a基因表达量是fad2a基因表达量的14.52倍,fad3b基因的表达量是fad2a基因表达量的16.14倍,表明这三个基因参与不饱和脂肪酸积累过程。在低亚麻酸含量品种‘Linola’30 d中,fad3a基因是fad2a基因表达量的52.71倍,fad3b呈下调趋势;在高亚麻酸含量品种‘CDCGold’30d中,fad3a基因与fad2a基因的表达量均呈下调趋势,fad3b的表达量为3.92倍;在中等亚麻酸含量品种‘内亚7号’中,fad2a基因表达量降低了0.31倍,fad3a基因是fad3b基因表达量的1.87倍。fad2b基因、fad2c基因熔解曲线不稳定,峰值低,可以在后续试验中继续探索。     

花生△12-脂肪酸去饱和酶基因RNAi表达载体的构建

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。     

生物信息学鉴定分析茄子脂肪酸去饱和酶(FAD)基因家族

脂肪酸去饱和酶(FAD)广泛分布于生物体内,其主要功能是在脂肪酸的生物合成过程中,从碳链中去除氢,从而产生碳碳双键。利用拟南芥FAD家族基因和茄子基因组数据,对茄子基因中可能含有的FAD基因进行鉴定和生物信息学分析。共鉴定出茄子FAD基因家族成员38个,其中FAB亚家族成员5个。对家族成员进行蛋白理化性质分析、系统进化分析和保守结构域分析,发现各亚家族成员间具有较为相似的保守基因序列和蛋白特性;基因结构分析表明,FAD家族成员间存在着不同的基因结构,但聚为一类的亚家族基因具有进化的保守性;染色体定位显示茄子FAD家族成员主要分布在5号染色体、6号染色体和4号染色体上。亚细胞定位预测茄子FAD家族成员主要分布在内质网、叶绿体和质膜上,FAB亚家族则全部定位在叶绿体上。     

球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定

从球等鞭金藻中克隆到一个Δ5去饱和酶基因, 命名为IgD5。系统发育树分析表明, 该基因编码产物与来源于巴夫藻Pavlova salina的Δ5去饱和酶亲缘关系最近。此前通过酿酒酵母表达系统, 证明IgD5对ω6脂肪酸具有Δ5去饱和酶活性, 但并未鉴定IgD5对ω3脂肪酸的催化活性。我们将IgD5转化能够内源合成二高-γ-亚麻酸(DGLA, 20:3Δ^8,11,14)和二十碳四烯酸(ETA, 20:4Δ^8,11,14,17)的已携带2个基因的拟南芥(简称TMA2), 通过PCR及RT-PCR筛选阳性植株, 提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸, 用气相色谱分析法检测到花生四烯酸(AA, 20:4Δ^5,8,11,14)和二十碳五烯酸(EPA, 20:5Δ^5,8,11,14,17), 含量分别达7.44%和2.07%, 转化效率分别为68%和60%, 证明IgD5在转基因植物中具有Δ5去饱和酶的活性, 对ω3/ω6脂肪酸没有明显偏好性, 并且催化活性远高于其在酵母中的活性。在转IgD5的TMA2中除了AA和EPA, 没有检测到其他新脂肪酸, 表明IgD5底物专一性很强, 是一个可用于植物转基因替代生产鱼油的良好基因。     

海藻糖合酶基因转化黑麦草及耐旱性研究

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)种子成熟胚为外植体,在MS附加5 mg/L 2,4-D、500 mg/L的L-脯氨酸、130 mg/L天门冬酰氨、10 mg/L AgNO3的诱导培养基(MSJ)上诱导胚性愈伤组织.用基因枪法将ubiqutin启动子驱动的海藻糖合酶基因(TPS基因)转入多年生黑麦草的胚性愈伤.在含有5 mg/LBialaphos的选择培养基上经过2个月的抗性筛选,抗性愈伤组织在分化培养基上生成了898株再生植株,其中的220株检测为阳性株,检测的阳性率占供检株数的24.5%.PCR分析及PCR-Southern杂交鉴定表明,TPS基因已整合到黑麦草的基因组中.抗旱性鉴定表明,转基因黑麦草在干旱胁迫条件下的保水能力增强,电解质渗出率明显低于对照,耐旱性提高.     

菠萝乌头酸酶家族基因鉴定及其表达分析

为了探究菠萝乌头酸酶家族基因在柠檬酸代谢中的作用,本研究系统鉴定了AcACOs家族基因及其生物学分析,共鉴定了6个菠萝乌头酸酶基因。根据构建系统进化树结果表明,单子叶植物与菠萝乌头酸酶基因家族亲缘关系更近,将6个成员命名为AcACO1～AcACO6;AcACOs理化性质分析结果表明,菠萝乌头酸酶家族基因差异较大,亚细胞定位均定位在线粒体;通过全基因组GFF注释文件,对其外显子-内含子结构进行分析,结果表明Ac ACOs家族成员均含有一个或多个外显子;可视化该家族成员种间进化关系、motif和基因结构分析结构,表明AcACOs可分成3个亚组,AcACO4、AcACO5和AcACO6属同一类群,为类群Ⅰ;AcACO1和AcACO2归属同一类群,为类群Ⅱ,AcACO3单独为一类群,为类群Ⅲ;基因组定位结果显示菠萝ACO家族基因共分布在5条不同的染色体中。联合单子叶和双子叶植物ACOs基因作了系统进化分析,采用邻接法(neighbor joining, NJ),其结果显示,AcACOs与大多数单子叶植物聚为一类;顺式作用元件预测分析结果表明,AcACOs含有数量较多的光响应元件和胁迫响应元件。...     

基因枪法转化马铃薯及转基因植株的获得

应用基因枪法将携带有FMDV P1全长基因的质粒pBI131SP1导入马铃薯茎段，通过在抗性培养基上严格筛选，获得了马铃薯再生植株。PCR检测及PCR—Southern杂交分析表明，已成功地将目的基因导入马铃薯基因组中。     

棉花FAD 2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建

 采用RT-PCR方法克隆了棉花△-12脂肪酸去饱和酶基因(GhFAD2-1)的cDNA全长序列,该基因含有1158 bp的完整开放阅读框。棉花FAD2-1是种子中编码催化油酸形成不饱和脂肪酸的关键酶的基因,选取GhFAD2-1基因中的一段特异的515 bp片段,构建了种子特异性启动子NAPIN调控的ihpRNA干扰表达载体pFGC1008-NAPIN-FAD2-1,同时构建了针对GhFAD2-1基因的人工miRNA表达载体pCAMBIA1302- amiRNA-FAD2-1。     

几丁质酶基因克隆及其野生蕉转化

本研究根据GenBank公布的木霉几丁质酶基因(chitinase)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从木霉(Trichoderma spp.)中克隆获得了几丁质酶基因全序列,编码区共1275bp,推测其编码424个氨基酸,该基因与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切几丁质酶基因chit42(GenBank accession No.L14614)具有99%的同源性。在此基础上,将获得的几丁质酶基因从pGEM-T载体中用XbaⅠ和BamHⅠ切下,克隆到pBI121植物表达载体的XbaⅠ和BamHⅠ位点,构建了植物表达载体pBI-chit并将其转入根癌农杆菌菌株EHA105。该菌株转化野生蕉(Musa itinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系,经过抗性筛选、胚的诱导和萌发,获得成熟体细胞胚和再生苗。通过GUS组织化学法检测和PCR方法鉴定,结果表明外源基因已经成功转入到野生蕉中。本研究为下一阶段转化香蕉栽培品种和筛选抗香蕉枯萎病新种质奠定一定的基础。     

榛树叶片膜脂脂肪酸组成与其耐寒性的关系

分析了耐寒性不同的6个榛树品种及其叶片膜脂、膜极性脂的脂肪酸组成与含量。榛树叶片膜脂脂肪酸主要是棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、二十二烷酸(C22:0)和二十四烷酸(C24:0);膜极性脂的脂肪酸主要是棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)。研究结果表明,榛树叶片膜脂不饱和脂肪酸含量高低与榛树的耐寒性强弱成正相关;榛树叶片膜极性脂不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值与榛树的耐寒性相关,耐寒性强的榛树的种子具有较高的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值。     

黄瓜抗寒基因CsRAV2的克隆与序列分析

中国黄瓜品种繁多,很早就开始选育黄瓜品种,但黄瓜的抗逆性不强,容易产生病虫害和冷害.黄瓜幼苗早春定植在露地或冬春季节在保护地栽培,经常会出现低温冷害的情况,这对黄瓜的早熟和高产会有较大影响.因此,分析和验证冷胁迫相关的基因,探究黄瓜抗低温冷害形成的机理,可以为黄瓜耐低温品种的选育和抗性品种的培育奠定基础.本研究中以吉林地区主要栽培品种'翠秋20'为试验材料,通过RNA-seq测序技术筛选出一个AP2/EREBP转录因子中RAV亚族的CsRAV2,推测该基因可能参与黄瓜幼苗冷胁迫,采用PCR技术克隆CsRAV2的序列全长,同时通过生物信息学分析比对,了解CsRAV2的结构域与分类,结果表明:CsRAV2编码区序列全长1122 bp,编码了344 aa,为疏水性蛋白质,无明显信号肽和无跨膜结构,亚细胞定位在细胞核.该研究结果为深入探究CsRAV2基因的功能提供了科学依据.     

牛胎儿成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因

为了为核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛胎儿成纤维细胞并进行了线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染牛胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR 鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2-3次后利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明,组织块贴壁后7天可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9天即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR 检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶基因整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶基因在转基因传代细胞中得到有效转录。本研究为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了条件。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物，以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板，通过PCR扩增，克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明，试验得到扩增片段长1148bp，含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接，构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR，为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

水杨酸诱导黄瓜幼苗抗冷性的基因表达

摘要 ：【研究目的】水杨酸 (Salicylic acid,SA) 能诱导植物提高抗生物胁迫和非生物胁迫(冷胁迫等)的能力。为研究SA对非生物胁迫下植物基因表达的影响,【方法】以黄瓜 (“新优30”) 幼苗为试材,用SA (3mmol/L,pH6.0) 溶液和蒸馏水处理后,经7℃冷胁迫48h,提取叶片总RNA并反转录cDNA,【结果】利用mRNA差异显示技术分离出12个差异表达cDNA片段,经反向斑点杂交验证其中2个（SICCL_1 和SICCL_2）为高差异表达片段。序列测定和Blast分析表明,SICCL_1与甜瓜中黄瓜花叶病毒 (Cucumber Mosaic Virus, CMV) 相关基因AM734282有88%同源性;SICCL_2与毛柽柳中NaHCO3胁迫相关基因THL24h-106有86% 同源性。【结论】由此推测,SA诱导植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫的能力可能是通过诱导植物某些相同基因的表达来实现的。     

昆虫抗冻蛋白基因转化烟草的抗寒性

将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MPAFP149亚克隆至pCAMBIA1302中,构建成单价植物表达载体pCAMBIA1302-MPAFP149,转化至农杆菌EHA105中,利用叶圆盘法转化烟草。通过PCR、PCR-Southern及RT-PCR检测表明抗冻蛋白基因已整合至烟草基因组中,并发生了转录。对T0代转基因烟草以－1℃处理48 h,转基因烟草的相对电导率和表型明显优于野生型烟草。室温恢复试验验证转基因烟草可存活并恢复生长,而野生型烟草受到了不可逆的低温冻害。研究证明转化后携带昆虫抗冻蛋白基因的烟草比野生型烟草具有明显的抗寒能力,该结果为减轻冷敏感经济作物在春季遭受霜害提供了理论依据和应用基础。     

抗逆调节转录因子CBF1基因提高多年生黑麦草的抗旱能力

通过逆境诱导型启动子rd29B为驱动,分别构建出含有抗逆调节转录因子CBF1基因的表达载体pBAC122,pBAC127,其中pBAC127以CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记。用高压氦气基因枪PDS1000/He分别将表达载体导入多年生黑麦草(Lolium perenne)品种Topgun的幼胚、成熟胚和愈伤组织。经除草剂Bialaphos抗性筛选和植株再生,获得了36棵转基因植株。经PCR,Dot-blotting的分子检测,CBF1基因已整合到多年生黑麦草部分转基因株系的基因组中。用5种不同浓度的除草剂涂抹黑麦草叶片,非转基因植株表现为不抗,而转基因植株最高可以抗到135~200 mg/L。叶片脯氨酸含量测定表明,经干旱处理或使用15%PEG处理,转基因植株叶片脯氨酸含量比未处理时显著提高,部分转基因植株提高幅度明显高于非转基因植株。经过25 d人工温室干旱处理,有3棵植株显示出存活迹象,复水后,有1棵植株(C122-7)恢复正常生长。从而表明,利用逆境诱导型启动子(rd29B)来调控外源CBF1基因的表达,能显著改良黑麦草的抗旱能力。     

甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶提高植物抗逆性功能分析

为研究甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的功能,本研究采用叶盘法将M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因转化烟草,获得T1代转基因植株,而后以野生型及转空载体植株为对照,分别在对照、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘露醇及200 mmol/L甘露醇的培养条件下进行植株生理指标的抗逆性分析。研究发现在100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl盐胁迫条件下,转基因植株的鲜重、木质素含量以及叶绿素含量均显著高于对照植株。此外,研究结果表明转基因植株在100 mmol/L甘露醇胁迫条件下根长和叶绿素含量显著高于对照植株,如转基因植株的根长和叶绿素含量分别为0.68 cm和 0.31 mg,而野生型植株的根长和叶绿素含量分别为0.51 cm 和0.18 mg。研究结果表明转M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因烟草植株对盐和干旱胁迫具有较强抗性,这为进一步深入研究M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因功能奠定重要基础。