我国部分小麦地方品种Waxy基因多样性研究

利用2对STS引物、1对SSR引物和1对基因特异引物分析了1739份中国小麦地方品种Waxy基因的变异情况。检测出Wx-Al基因缺失突变材料3份，Wx-Bl基因缺失突变材料25份，Wx-Dl基因缺失突变材料3份。利用SDS-PAGE方法对以上Waxy基因突变材料在蛋白质水平上进行鉴定，验证了Waxy分子标记在种质资源研究中的有效性。向育种家推荐一批具有不同Waxy基因缺失的地方种质，并提供了全部品种的缺失类型。     

西南糯玉米地方品种waxy基因序列多态性分析

为了解我国西南地区糯玉米和硬粒玉米waxy基因核苷酸多态性, 对23份中国西南玉米地方品种(16份糯玉米和7份硬粒玉米)、2份美洲糯玉米种质的waxy基因第9外显子至第14外显子之间核苷酸序列进行测定, 将所得序列与GenBank中的16份同源序列(来自小颖大刍草、繁茂大刍草和美洲地方栽培品种)进行序列比对。结果表明, 西南糯玉米、西南硬粒玉米和小颖大刍草分别具有14、19和40个多态性位点, 西南糯玉米waxy位点核苷酸多态性为西南硬粒玉米的30%, 是小颖大刍草的14%, Tajima’D检验仅在糯玉米群体D值显著, HKA检验表明waxy位点未受选择作用; 序列比对发现12份西南糯玉米第10外显子同一位置缺失15个核苷酸, 该位点恰为糖基转移酶结构域的起始位置。可见我国糯玉米通过较为独特的突变机制而形成, 在进化过程中经历了驯化瓶颈, 奠基者效应使西南糯玉米waxy位点核苷酸多态性大大降低, 从近缘物种中引入等位变异是改良玉米淀粉质量和产量的关键。     

小麦抗叶锈病基因Lr24的一个新STS标记

来源于长穗偃麦草的基因Lr24对小麦叶锈病具有很高的抗性, 本研究旨在开发用于Lr24基因分子标记辅助育种的新的分子标记。从定位于小麦3D染色体的22对SSR、EST-SSR引物中筛选出4对揭示TcLr24多态性的引物, 用468株F2抗感群体对这4对引物进一步检测, 得到1个与Lr24共分离的EST-SSR标记Xcwem17。对该标记进行测序, 并设计了STS引物。用该STS引物及已知的Lr24 SCAR引物对试验群体进行验证, 两对引物在该F2群体中均表现共分离, 且Xcwem17可在TcLr24单基因系和已知含Lr24的农家品种泰山1号中可扩增出180 bp单一条带, 感病对照及其余7个近等基因系无扩增。该EST-SSR标记可直接用于分子标记辅助选择。     

小麦Wx基因突变体的建立及其淀粉特性的研究

以小麦品种藁城8901为母本，糯麦1号为父本，用“单粒传”法构建了一个含有8种Wx基因突变类型的重组自交系群体 (RIL) 。应用改良的SDS-PAGE方法对RIL-7的Wx基因突变类型进行检测，发现在228个株系中，正常类型的株系有34个，Wx-A1突变体为26个，Wx-B1突变体为32个，Wx-D1突变体30个，Wx-A1和Wx-B1位点同时突变的有28个，Wx-A1和Wx-D1位点同时突变的有20个，Wx-B1和Wx-D1位点同时突变的为28个，3个Wx基因位点均突变的为16个。卡方测验证明，3个Wx基因位点的突变符合孟德尔遗传规律，属于质量性状遗传。田间试验表明，8种类型之间在初花期、株高和穗粒数上无显著差异，但在穗长、每穗小穗数和千粒重上Wx-A1突变型显著低于其他7种类型，而7种类型间无显著差异。淀粉特性研究表明，不同Wx蛋白缺失显著影响直链淀粉含量、淀粉糊化特性和淀粉凝胶的质构剖面分析 (TPA) 特性。正常类型的直链淀粉含量最高(20.8%)，糯麦的最低(1.1%)。糯麦淀粉的峰值黏度和稀澥值较高，但其低谷黏度、最终黏度和反弹值较低，与其他缺失类型间差异达5%显著水平。凝胶的TPA测试表明，随着直链淀粉含量的降低，凝胶的硬度、黏着性、弹性、胶着性和咀嚼性显著降低，而黏聚性和回复性显著升高。直链淀粉含量与糊化特性的低谷黏度、最终黏度、反弹值、峰值时间和糊化温度之间正相关达1%显著水平(r=0.892~0.965)，与峰值黏度、稀澥值呈1%水平负相关( r=－0.892, r=－0.945)；直链淀粉含量与凝胶TPA参数的黏聚性、回复性呈极显著负相关(r=－0.928, r=－0.829)，与凝胶的硬度、黏着性、弹性、胶着性和咀嚼性呈极显著正相关( r=0.869~0.979)。     

玉米Opaque-2基因内3个SSR位点的显性等位变异及其对赖氨酸含量的影响

以10个O2O2基因型的普通玉米自交系和3个o2o2基因型的高赖氨酸玉米自交系为材料，用3对O2基因内SSR引物phi112、umc1066和phi057进行PCR扩增产物电泳图谱分析和特异片段序列比较分析，以期了解O2位点显性等位变异对赖氨酸含量的影响。结果表明，玉米phi112、umc1066和phi057三个SSR位点均有丰富的显性等位变异，phi112位点的变异主要发生在其SSR序列的两侧，umc1066和phi057两位点的变异主要表现为SSR序列内部重复数目的变化和点突变。这些变异均对玉米籽粒的赖氨酸含量有影响。还讨论了这些显性等位变异影响O2基因的转录效率及其翻译产物对激活玉米醇溶蛋白合成能力改变的可能机制。     

大肠杆菌中的表达

 在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）cry2Ac4基因;笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

一个水稻抽穗期主基因Hd(t)的遗传分析及分子定位

从缙恢10/R21的杂种后代中发现了一个抽穗期稳定遗传的迟熟恢复系N91(110~114 d)，以早熟不育系金23A(89~94 d)作为杂交和回交亲本，获得的F₂和BC₁F₁群体抽穗期均表现双峰分布，χ²检测表明其抽穗期受一对主基因控制，暂命名为Hd(t)。在400多对SSR引物中筛选出5对在早熟基因池和迟熟基因池中表现差异的引物，进行单株验证，用回交群体进行基因定位，发现位于第7染色体长臂末端的SSR标记RM1364和RM3555与Hd(t)连锁，遗传距离分别为32.7 cM和22.5 cM。在目标区域进一步合成8对SSR引物，将Hd(t)基因定位在RM22143与第７染色体末端之间，与RM22143相距12.9 cM。该结果为Hd(t)基因的精细定位、分子标记辅助育种和基因克隆奠定了基础。     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其受恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针, 对NCa不育系、保持系和可育F₁幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rrn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F₁中的转录没有差异；只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1.1、0.9和0.6 kb，orf139检测到0.8和0.6 kb 2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0.6 kb转录本，而在可育F₁中检测到0.6和1.2 kb的转录本。NCa CMS不育的形成可能与orf222、orf139和atp9基因的表达有关；讨论了恢复基因在F₁育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

谷子显性雄性不育基因Msch的AFLP标记

利用雄性不育是实现谷子杂种优势利用最经济、有效的途径之一。为了寻找与不育基因Ms^ch紧密连锁的分子标记，提高不育系的选育效率，本研究构建了Ms^ch不育/可育近等基因系（NILs），通过对400对AFLP引物组合进行筛选，找到了与不育基因紧密连锁的两个AFLP标记（P17/M37₂₂₄和P35/M52₂₀₈），与不育基因的遗传距离分别是2.1 cM和1.4 cM，而且位于不育基因的同一侧,标记间相距0.7 cM。这两个AFLP标记可有效用于分子标记辅助选择育种。     

山东省普通小麦醇溶蛋白Gli-1和Gli-2位点等位基因的遗传变异

采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)，分析了山东省种植面积较大的37个小麦品种醇溶蛋白Gli-1和Gli-2位点等位基因的组成特点。结果表明，山东小麦在醇溶蛋白Gli-1 (Gli-A1、Gli-B1和Gli-D1) 和Gli-2 (Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2) 位点存在多样性，共鉴定出58个等位基因，出现频率较高的有6个，分别为Gli-A1a (48.6 %)、Gli-B1l (35.1%)、Gli-D1k (35.1%)、Gli-A2b (35.1％)、Gli-B2g (35.1％)和Gli-D2a (29.7％)，其中Gli-B1l出现频率较高，表明1BL/1RS易位系在山东小麦中存在比较普遍。醇溶蛋白6个主要位点的遗传变异系数较高，平均为0.7930，变幅为0.7297～0.8269，其中Gli-D2位点遗传多样性最高，Gli-A1最低。对具有优质醇溶蛋白等位基因Gli-B1b或Gli-A2b的品种进行了高分子量谷蛋白亚基的组成分析,表明烟农15、烟优361、山农98-1和山农93-52同时含有优质谷蛋白5＋10亚基，在小麦育种中可利用这些优质亚基基因。     

Genetic variation for waxy proteins and starch properties in Italian wheat germplasm

Granule-bound starch synthase (GBSS) is the primary enzymeresponsible for the synthesis of amylose in amyloplasts of cereal endospermcells. In bread wheat there are three structural genes (Wx-A1, Wx-B1,and Wx-D1) encoding for isoforms of GBSS. The loss of one or moreGBSS isoforms results in the reduction (partial-waxy) or absence (waxy) of amylose in the starch. Waxy wheats may find application inthe production of modified food starch and their flour may be used toextend the shelf life of baked products. In order to breed high qualitywheats able to produce bread with delayed staling, the genetic variabilityfor the waxy trait in our germplasm has been investigated. Weanalysed 288 cultivars of bread wheat, 139 cultivars of durum wheat andabout 200 accessions from other Triticum species. Gel electrophoresisshowed 63 bread wheats deficient in the Wx-B1, one in the Wx-A1 and one in the Wx-D1 protein isoforms, as well as one Triticum dicoccum lacking the Wx-A1 isoform. None of the analysedTriticum monococcum, Triticum durum, Triticum speltaand Triticum timopheevi accessions showed mutations at the Wxloci. The wheat accessions with Wx mutations were evaluated with aRapid Visco Analyser (RVA) to investigate starch properties. All theanalysed cultivars showed Peak Viscosity and Final Viscosity different fromthe normal wheat. Other analyses to evaluate the rheological characteristicsof the partial-waxy genotypes are under way and a breedingprogramme to select new waxy wheat varieties is in progress     

Characterization of an Italian rice germplasm collection with genetic markers useful for breeding to improve eating and cooking quality

Gelatinization temperature and apparent amylose content are key parameters used to describe the eating and cooking qualities of rice. Sequence variants of SSIIa and Waxy genes are important determinants of gelatinization temperature and apparent amylose content, respectively. A collection of Italian non-glutinous japonica rice accessions was characterized for sequence polymorphisms in SSIIa and Waxy genes, in comparison with non-Italian japonica and indica genotypes. For SSIIa two markers, SNP3 and SNP4, were used. A PCR amplification of multiple specific alleles protocol was developed for the identification of G/T polymorphism in 5′ splice site of first intron and A/C polymorphism in exon 6 of the Waxy gene. Based on simple allele-specific PCR, it can be proposed as a user-friendly, cost-effective tool for marker-assisted selection of amylose content. The collection was characterized also for the (CT)n repeats in exon 1 of the Waxy gene. The results showed that while SSIIa haplotypes were rather similar between Italian and non-Italian japonica rice, the Waxy gene haplotype T/A/(CT)18 was largely predominant in Italian accessions, other haplotypes, well represented in non-Italian japonica [T/A/(CT)19] and indica [e.g. G/C/(CT)20] genotypes, were present at lower frequency. Grain starch quality traits as apparent amylose content and RVA profile were also analysed. The In1/Ex6 SNP haplotypes of Wx gene were found to explain 79 % of variation in apparent amylose content, and 36, 22 and 25 %, of variation in the RVA parameters peak viscosity, breakdown and setback, respectively. The additional use of (CT)n repeats marker further improved the association of haplotypes with RVA parameters.     

山西冬小麦品种Waxy蛋白分析及分子标记研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分析了山西100份小麦品种(系)Waxy蛋白的缺失类型,筛选出缺失Wx-B1蛋白亚基的材料8份。利用2个STS标记和1个SSR标记对不同Waxy蛋白缺失类型进行鉴定,验证其在分子标记辅助育种中的有效性,结果表明:Wx-7A位点的STS引物在野生型中扩增出1条450 bp的特异带,而在缺失Wx-A1蛋白亚基的突变材料中扩增出1条327 bp的特异带;Wx-4A位点的STS引物在野生型中扩增出1条440 bp的特异带,缺失Wx-B1蛋白亚基的突变材料中没有该扩增片段;Wx-7A,Wx-7D位点的SSR引物在野生型中分别扩增出1条265 bp和1条204 bp的特异带,在缺失Wx-A1和Wx-D1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带。这3个标记可以用于分子标记辅助育种。     

小麦品种中梁22抗条锈病基因的遗传分析和分子作图

对中梁22/铭贤169杂交F₂群体苗期抗条锈病鉴定及中国春单体系抗病基因的染色体定位发现, 中梁22携带1个显性(暂命名YrZhong22)和1个隐性抗病基因, 前者位于5B染色体。由中梁22´铭贤169的F₂群体构建抗病、感病池, 用SSR标记结合集群分离分析法(BSA), 建立了与YrZhong22连锁的4个微卫星标记Xwmc289、Xwmc810、Xgdm116和Xbarc232, 并将YrZhong22定位于小麦5BL染色体。YrZhong22与相邻微卫星位点Xwmc810和Xgdm116的遗传距离分别是2.7 cM和4.4 cM。系谱分析及分子标记分析表明, YrZhong22可能是一个来自中间偃麦草的新抗条锈病基因。     

中国小麦育成品种和农家种中慢锈基因Lr34/Yr18的分子检测

Lr34/Yr18是重要的慢叶锈和慢条锈基因, 携带该连锁基因的小麦品种被广泛种植于世界许多国家。利用STS标记csLV34对慢叶锈和慢条锈基因Lr34/Yr18进行分子检测的结果表明, 我国231份育成品种(系)中仅有14份材料携带Lr34/Yr18基因, 占6.1%。不同麦区分布频率不同, 其中北部冬麦区为零, 黄淮冬麦区、长江中下游冬麦区、西南冬麦区和西北春麦区分别为3.0%、21.4%、16.7%和33.3%。在422份农家种中, 359份含有Lr34/Yr18基因, 占85.1%。Lr34/Yr18基因在不同麦区的分布频率也存在差异, 北部冬麦区、黄淮冬麦区、长江中下游冬麦区、西南冬麦区、南部冬麦区和西北春麦区分别为89.6%、77.4%、93.1%、93.8%、96.6%和61.1%。csLV34标记扩增产物为150 bp和229 bp的片段, 能有效鉴别品种是否携带Lr34/Yr18基因, 是一个重复性好、准确率高的分子标记, 可用于小麦Lr34/Yr18基因的鉴定与选择。     

紫花苜蓿Na+/H+ 逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性

以紫花苜蓿(Medicago sativa)为材料, 利用反转录PCR方法分离了NHX1全长cDNA(命名为MsNHX1)。Southern杂交结果表明, 在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明, 该基因所编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达MsNHX1-GFP融合基因的结果表明, MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性, 说明MsNHX1具有转运Na⁺的功能。在拟南芥中表达MsNHX1能显著提高植株耐受盐胁迫的能力; 而且在受到盐胁迫时, 转基因植株比野生型的渗透调节能力更强, 生物膜受破坏程度降低, 光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白, 在植物耐受盐胁迫过程中起重要作用。     

利用原位杂交及CAPS标记分析芸薹属A、B和C基因组间的关系

以来源于Brassica rapa基因组(AA)的重复序列(151 bp)为探针, 分别同二倍体白菜型油菜(AA, 2n=20)、甘蓝(CC, 2n=18)和异源四倍体芥菜型油菜(AABB, 2n=36)的中期染色体杂交, 白菜型油菜和甘蓝的所有染色体上都有杂交信号, 芥菜型油菜的染色体上显示出20个明显的信号, 其余染色体上信号很弱或无, 可以区分出A和B基因组。对来源于油菜3个基本种与3个复合种FAE1基因进行CAPS分析表明, 3个基本种表现出不同的酶切式样, 用Mbo I和Msp I酶切表现出多态性, 基因组A和C非常相似, 而基因组B与A、C关系较远, 同时3个复合种也并不是2个基本种的简单相加, 表明异源四倍体在长期进化过程中可能发生了重排和重组。     

甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA克隆和9个授粉27 d后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为fad2I和fad2II。RT-PCR分析发现在授粉27 d的种子中fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。