马铃薯双抗病毒转基因技术初步研究

针对马铃薯生产中存在的病毒型退化和转基因本身存在的生物安全性问题,把新近发展迅速的RNA干扰技术和无标记转基因技术引入植物抗病毒基因工程,培育生物安全型抗多病毒转基因马铃薯,探索一条多抗甚至多免疫的生物安全型转基因新途径。通过农杆菌介导,将抗马铃薯X病毒和Y病毒的RNA干扰型基因结构转入马铃薯大西洋、克新1号等新疆主裁栽培品种,通过PCR检测获得对X病毒和Y病毒具有双重高抗或免疫的无标记基因的高生物安全型转基因马铃薯植株。最终,通过多次筛选试验,确定了农杆菌OD600为0.3~0.5时为宜,但以0.5最佳,预培养2 d,侵染时间为10 min,共培养2~3 d的最佳转化条件。通过特异性引物PCR扩增,部分再生植株得到与阳性对照一致的目的条带,初步确定RNAi基因已整合到马铃薯基因组中。本研究获得的抗病毒无标记转基因马铃薯,其目的基因为RNA干扰型结构,转基因植株的抗性是RNA沉默的结果。由于所转基因的m RNA已经降解成小片段,转基因植株不存在标记基因,规避了目的基因和标记基因潜在的生物安全性问题。     

马铃薯Y病毒siRNA介导抗病基因工程研究进展

马铃薯病毒病是危害马铃薯生产的重要因素,尤其马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)严重影响马铃薯产量和品质,为防治带来很大困难。近年来,通过基因工程技术培育抗病毒转基因植株为抵抗PVY侵染提供有效途径。简述了目前PVY病毒siRNA介导抗病基因工程的主要方法策略,包括PVY不同功能基因介导的病毒抗性差异、影响PVY抗病毒基因工程效率的主要因素以及PVY不同株系联合抗病基因工程研究概况,分析了这些方法存在问题及发展趋势,旨在为更好地控制PVY危害提供借鉴。     

植物抗病毒基因工程研究进展

植物病毒是一类重要的植物病原微生物,每年都给全球的农业生产带来了巨大的损失。近年来,通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文阐述了目前植物抗病毒基因工程的主要方法策略,包括由蛋白质介导、RNA介导、非病毒来源基因介导及交叉保护介导的抗性机制,分析了这些机制的存在问题及发展趋势,同时还对一些RNA水平的抗性策略进行了探讨     

GFLVCP 基因 RNAi 载体构建及其在转基因烟草中的干涉效果

为探讨RNAi策略在抗GFLV基因工程中的效果,通过RT-PCR克隆获得了310 bp的GFLV外壳蛋白基因保守片段,采用Gateway技术将该基因片段连入目标载体pHELLSGATE12构建了RNAi植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入烟草中,RT-PCR检测表明目的基因片段已整合到烟草基因组中并在RNA 水平上得到表达,病毒接种结果显示阳性植株的发病率明显低于对照,说明在转基因植株中dsRNA表达可干涉GFLV侵染过程。     

苹果抗ASPV病毒RNAi载体构建及转化砧木M26的研究

为获得抗病毒的转基因植物新材料,采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体,并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化,成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料,反转录合成c DNA第一链,采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段,通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体p ENTR/SD/D,构建了入门克隆载体p EN-ASPV,再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体p Hellsgate12,构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV,并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中,获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘,经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽,进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株,对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示,RNAi表达载体上携带的外源基因片段(489 bp)已成功转入苹果砧木材料M26中,并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料,为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。     

优化的VHb基因和GFMcryIA基因构建的双价基因在烟草中的表达

利用人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体。通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了36株卡那霉素抗性植株。经转基因植株的PCR及Southern blot检测，证实了双价基因在35株烟草基因组中的整合。Western blot检测证实了VHb基因的表达，杀虫实验证实GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。且转基因烟草平均每株干重比非转基因烟草植株高7％。本研究结果表明转基因育种技术在培育出既高产又具抗虫性的作物或经济作物新品种方面具有良好的应用前景。     

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemGl的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟（Nicotiana tobacum cv．Samsun NN）,获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus）接种试验。接种5d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟中及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟(Nicotiana tobacum cv. Samsun NN),获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)接种试验。接种5 d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

薤白EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性

葱属植物薤白具有较强的草甘膦抗性.将薤白中与草甘膦抗性相关的EPSP合成酶基因(EPSPsA)cDNA重组到植物表达载体pWM101中,构建薤白植物表达EPSPsA重组载体,采用根癌农杆菌介导法将其转入烟草品种WS38,获得转薤白EPSPsA基因烟草.PCR分析表明,目的基因已经整合进烟草基因组中.对转基因烟草愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因烟草对草甘膦的耐受性明显提高.     

新疆哈密瓜AT2基因的克隆及初步功能验证

本研究利用RT-PCR技术从抗霜霉病哈密瓜(Cucumis melo L.)品种MR-1中克隆到AT2基因,其整编码区为1 229 bp,编码401个氨基酸,同源比对结果为99%,将其编码的丝氨酸乙醛酸转氨酶蛋白序列与多种物种进行系统进化树分析,结果显示,甜瓜与黄瓜SGT蛋白同源性较高,遗传距离最近,推测在同属中该蛋白进化相对保守。在线分析表明SGT蛋白不含信号肽及跨膜区,即该蛋白为非跨膜蛋白。RT-PCR分析表明AT2基因随着植株生长时期不同表达量不同,开花期表达量最高,幼苗期至开花期表达量呈上升趋势;且不同组织中,叶片表达量显著高于茎、根。构建了p CAMBIA2300-AT2植物表达载体,运用农杆菌介导法转化烟草,抗性筛选获得7株阳性转基因烟草;经q RT-PCR检测,AT2基因在不同株系转基因烟草T0代中表达量均高于野生型。通过对转基因烟草进行抗病性鉴定,转基因烟草对靶斑病、赤星病的抗性高于野生型烟草。本研究表明,过表达AT2基因能够提高烟草对部分真菌性病害的抗性。