基于MS2蛋白系统的可移动性RNA鉴定方法

为了方便快速地鉴定RNA的移动性,研究RNA参与植物生长发育以及生理响应过程的胞间运输机制,减少试验成本,将含有24个茎环串联重复的RNA结构(SL24)连入双元载体pUbiK成功构建了表达载体pSL24UbiK,再利用同源重组的方法将可移动性RNA FT和不可移动性RNA GUS片段分别连入表达载体pSL24UbiK成功构建了重组载体pSL24UbiK-FT、pSL24UbiK-GUS。利用农杆菌介导法,将pSL24UbiK-FT、pSL24UbiK-GUS分别与p1390-35S-MS2_(FD)-GFP共同在烟草叶片中瞬时表达。在Ubiquitin启动子驱动下,SL24和目标RNA形成融合片段。MS2/SL24系统的另一组分MS2蛋白与绿色荧光蛋白融合形成MS2-GFP,噬菌体外壳蛋白MS2可识别SL24 RNA结构,在共聚焦显微镜下观察烟草叶片中GFP的细胞定位情况。结果显示,可移动RNA FT在细胞质附近显示出点状信号,不可移动RNA GUS在细胞质附近没有检测到荧光信号,只在细胞核位置有荧光信号的出现。结果表明,利用该系统将目标RNA连接到表达载体pSL24UbiK上,通过与p1390-35S-MS2_(FD)-GFP共侵染烟草叶片,在共聚焦显微镜下观察GFP的细胞定位情况就能够确定RNA在细胞内是否可以移动,为研究RNA的移动性提供了新的技术方法。     

玉米蛋白激酶ZmSPK1在转基因拟南芥中的定位

为了研究玉米蛋白激酶ZmSPK1在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,分别构建了以35S为启动子表达ZmSPK1-GFP融合蛋白和GFP的植物表达载体35S∷ZmSPK1-GFP和35S∷GFP,用花粉浸醮的方法将表达载体转入拟南芥,筛选稳定表达株系,在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmSPK1在植物细胞中的定位。研究结果表明:融合蛋白ZmSPK1-GFP的荧光分布与游离GFP相似,在细胞浆及细胞核内均可见。与单独表达GFP相比,融合蛋白ZmSPK1-GFP在核内信号更强,推测ZmSPK1是可溶性蛋白,定位在核内。     

维管特异表达启动子BSP的克隆与活性检测

为了研究维管特异表达启动子BSP的活性和组织特异性,从杨树基因组中克隆得到维管特异表达启动子BSP,利用该启动子与绿色荧光蛋白（GFP）报告基因构建植物表达载体,采用基因枪法转化烟草叶片,并在高渗培养基上培养过夜,后转移到诱导培养基上(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Kan 100 mg/L)培养生根并长到一定高度后,剪下已形成维管组织的叶脉和根,制成切片,然后在OLYPUS BX51/BX52型荧光显微镜下用蓝光激发,观察各个组织细胞中的绿色荧光,同时以未转化的烟草材料做为对照。结果表明：BSP启动子所驱动的GFP基因在烟草的维管组织细胞中得到了高水平的表达,而在烟草的其他组织及对照的任何组织中几乎不表达。通过GFP在烟草维管组织中的瞬时表达,表明了该启动子具有维管组织特异性表达活性特点。     

pCB-zeolin-GFP表达载体的构建及瞬时表达

为利用荧光蛋白基因GFP检测外源基因在转基因植株中的表达和定位,构建含有GFP基因的植物表达载体pCB-zeolin-GFP。在目的基因的开放阅读框（ORF）两端设计引物,并引入酶切位点和保护碱基,用PCR方法从pDHA扩增得到zeolin基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302植物表达载体,经回收、连接、转化、鉴定后,利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞,通过共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。构建了zeolin基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的植物表达载体pCB-zeolin-GFP,并在洋葱中得到了表达。构建的融合植物表达载体pCB-zeolin-GFP正确,该载体的成功构建为今后进行基因转移、基因功能研究及培育新品种奠定了基础。     

具有荧光标签的猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得...     

高羊茅光周期调控基因FaCONSTANS亚细胞定位与差异表达分析

构建高羊茅光周期调控基因FaCONSTANS与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体P-FaCONSTA NS-hGFP,基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达.并运用实时荧光定量PCR研究光周期调控基因FaCONSTANS在长日照与短日照条件下昼夜24 h的表达差异.结果表明:FaCONST...     

DREB1C-GFP融合基因植物表达载体的构建

为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。     

玉米ZmPti1在转基因拟南芥中的亚细胞定位

Pti基因不但在植物的抗病信号传导中起着非常重要的作用,而且玉米中一个类Pti1基因——ZmPti1还参与了植物抗盐的信号传递。为了研究ZmPti1 在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,分别构建了以35S 为启动子表达ZmPti1-GFP 融合蛋白和GFP游离蛋白的植物表达载体pGreen0029-35S∷ZmPti1-GFP 和pGreen0029-35S∷GFP, 通过花浸蘸法转入拟南芥中进行过量表达。在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmPti1在植物细胞中的定位。研究结果表明: ZmPti1是一个可溶性蛋白,定位在细胞质内。     

绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是源于海洋生物多管水母属(Aequoria Victoria)的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。GFP的荧光反应不需要任何底物及辅助因子,使表达检测非常简单。同时,GFP在细胞中呈自主表达,没有细胞种类、位置和种属的特异性。GFP对受体细胞无毒性,对目的基因没有影响。因而可以很方便的对活体进行观察,来研究GFP基因的表达。由于GFP对光漂白、氧化剂、还原剂、酸、碱以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性,因此,GFP作为报告基因可用来监测转基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。本文对GFP基础理论研究及在植物分子生物学中的应用作了综述。     

一种快速检测启动子调控基因表达活性方法的探讨

启动子活性检测是基因工程实验的重要组成部分,笔者利用绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因,对rd29A启动子在受体细胞中调控基因表达的活性进行检测,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,培养24h后在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况,并通过软件测定不同培养条件下GFP基因表达后的荧光强度,能较为准确的鉴定该启动子的活性大小,并达到量化目的。方法简单、省时、可靠,可以作为一种有效的检测启动子活性的方法。     

烟草表达抗病基因同源物(RGAs)的鉴定及RGA-SSR标记的开发

烟草是研究植物与病原菌互作的理想材料。鉴定烟草抗病基因及其同源物对揭示抗病机制具有重要意义。近年来公共数据库不断增长的EST序列为烟草表达RGA的鉴定提供丰富的数据。本研究通过拼接GenBank收录的412 325条烟草EST序列,获得149 606条Uni-EST序列。随后利用已克隆的112个植物R基因蛋白序列对其扫描,检测出1113个NtRGA,其中有273、546、53、102和30个分别包含NBS-LRR、LRR-PK、LRR、PK和Mlo结构域,另有109个未检测到结构域。通过序列比对将1071个NtRGA定位于N. benthamiana基因组712个位点上。经搜索,从72个NtRGA中检测出78个SSR,根据其侧翼序列设计64对引物。54对成功从烟草基因组DNA中扩增出清晰条带,9对在24个普通烟草品种间检测出多态性,检出等位基因数2~4个,平均2.56个;41对在6个烟草种间检测出多态性,检出等位基因数2~4个,平均2.61个。     

烟草SKP1基因cDNA的克隆分析及原核表达

应用DDRT-PCR法获得可被壳寡糖诱导的枯斑三生烟SKP1基因cDNA的3’端序列,通过5’ RACE扩增该基因cDNA的5’ 端,进而扩增此基因cDNA的全长,通过同源性比较分析,与本塞姆氏烟草的SKP1基因同源性达81%,其cDNA全长653 bp(GenBank登录号：AY702087),其中编码区位于73~540 bp,编码一条155个氨基酸的多肽。经预测该多肽的分子量为17 527.78 Da,等电点为4.57,定位于细胞质,功能结构域分析结果显示在4~105位氨基酸有一明显的Skp1结构域,其E值为1.25e-52,因此推断该基因为枯斑三生烟的SKP1基因。将该基因编码区亚克隆到原核表达载体pET23b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达出与预测分子量一致的蛋白。为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

地黄花叶病毒（ReMV）生物学特性研究初报

地黄花叶病毒（Rehmannia mosaic virus,ReMV）是地黄上发生的一种烟草花叶病毒属（Tobamovirus）可能的新病毒。笔者对ReMV的生物学特性进行了初步研究。结果表明,ReMV粒子形态为杆状,可以侵染茄科、番杏科、十字花科和藜科等4科10种植物,其中在茄科的心叶烟、黄花烟、蔓陀罗;番杏科的番杏;藜科的苋色藜和昆诺藜上表现为局部枯斑症状。在红花烟、普通烟、番茄和白菜等植物上表现为系统花叶症状。ReMV的钝化温度为90-95℃,稀释限点为10-5-10-6,20-22℃条件下的体外存活期在60 d以上。     

烟草对花叶病毒诱导抗性及其遗传传递效应的研究

采用化学诱导的方法进行烟草对花叶病毒的诱导抗性的试验研究。发现用Ｓ３０和Ｌ１两种诱抗剂均能在烤烟，白肋烟和心叶烟上诱导出对ＴＭＶ的抗性。诱抗效应达１９．１％－３５．６％。此外，诱抗后心叶烟，白肋烟还表现出枯斑反应提前和枯斑缩小等抗性增强反应。将诱抗材料子代接种ＴＭＶ，证明有诱抗性传递现象，其传递效应为２５．２％－４２．６％。经连续三代用Ｌ１诱抗剂在同一烤烟品种（Ｇ１４０）的苗期和花期分别诱导，其子     

一个棉花纤维伸长期优势表达启动子pGhFLA1的克隆与鉴定

棉花纤维是研究单细胞生长发育的良好模式细胞,寻找在棉花纤维发育时期优势表达的启动子,对于棉花纤维发育的功能基因组研究非常重要。本试验对发掘到的一个在纤维伸长期优势表达基因GhFLA1的启动子进行克隆,并将该启动子融合GUS转化棉花和烟草。转基因棉花的GUS蛋白染色表明,在0~20 DPA(days post anthesis)的纤维中检测到GUS蛋白,同时在柱头、雄蕊、萼片、胚根、子叶和根中也检测到GUS蛋白,但在花瓣、叶片和苞叶中没有检测到。同时GUS定量检测结果显示,pGhFLA1驱动GUS蛋白积累的高峰是在20 DPA的纤维中,其驱动GUS表达的能力是Ca MV 35S::GUS的22倍。转基因烟草组织化学染色显示pGhFLA1可以驱动GUS在叶片及叶片的表皮毛中优势表达,同时在子房、柱头、花药、苞叶、花柄基部、花瓣、种子等生殖器官上也存在GUS蛋白。启动子pGhFLA1在棉花纤维和烟草叶片的表皮毛中优势表达,可用于棉花纤维功能基因组研究,在改良纤维品质育种中具有潜在的应用价值。     

应用SRAP与ISSR分析烟草种质资源遗传多样性及遗传演化关系

应用ISSR与SRAP两种分子标记,研究国内外96份烟草种质的遗传多样性及不同栽培类型种质的遗传演化关系。表明烟属种间具有丰富的遗传多样性,种间的遗传相似性(GS)在0.28~0.58之间,遗传分化系数(Gst)为0.83。普通栽培种品种间遗传多样性水平较低,品种间的遗传相似性在0.61~0.99之间,栽培种内的遗传多样性为烤烟>晒晾烟>白肋烟>香料烟。当相似系数在0.67作切割线时,基于2种标记的96份烟草种质资源的聚类结果为,(1)普通烟草栽培品种材料91份聚在同一大类,而黄花烟、黏烟草、浅波烟草、哥西氏烟草、香甜烟草5个种也分别为单独的个类,同普通烟草栽培种类群完全区别开来;(2)从进化上看,烤烟和晒晾烟间的遗传进化关系最近,香料烟和黄花烟之间的亲缘关系较远;普通烟草栽培种中国内外来源的烟草品种亲缘关系极其相近,遗传分化现象甚微;(3)2种分子标记虽然原理不同,但分析结果趋势相近(r=0.68,P=1.000)。     

漾濞大泡核桃JsWRKY1过表达增强转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性

为进一步研究JsWRKY1的生物学功能,构建JsWRKY1的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的JsWRKY1转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。JsWRKY1过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因MnSOD、Cu/Zn SOD、CN、NADPH oxidase和PR1的转录水平。与野生型烟草相比,JsWRKY1转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示,JsWRKY1转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外,用胶孢炭疽菌接种烟草叶片,转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性明显增强。显然,JsWRKY1是漾濞大泡核桃中正调控病害防卫反应的转录因子。     

Nicotiana tabacum L. as a source of cytoplasmic male sterility in interspecific cross with N. alata Link & Otto

A new source of cytoplasmic male sterility (CMS) in tobacco with interspecific origin is reported. In traditional selection wild tobacco species have been used as donors of cytoplasm. In the present study the cultivated species Nicotiana tabacum L. (n = 24) is a source of CMS. It was used as female parent and N. alata (n = 9) was involved as a pollinator. The F1 hybrid of this cross was completely sterile. Tissue culture method was applied to restore the female fertility. Regenerants obtained from the 5th passage were successfully pollinated with N. tabacum and seed-containing capsules were formed. All BC1P1 plants were male sterile. They possessed normally developed corollas, three-loculed or deformed pistils, and 1–2 stamens modified into secondary pistils. In some plants stamenless flowers were observed. Male sterility of BC1P1 was preserved in BC2P1–BC7P1 progenies confirming its cytoplasmic nature. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

烟草叶绿体16S启动子的克隆改造及转基因植株的获得

设计引物并克隆了烟草叶绿体16SrDNA基因的启动子,并在其下游加入了rbcL基因的SD序列,以使该启动子能有效翻译外源基因;进一步以aadA基因作为外源基因,以psbA基因的3’序列为终止子,构建成aadA基因表达盒;将此表达盒插入烟草叶绿体同源片段trnK-psbA-trnH中,构建成烟草叶绿体转化及表达载体p16T。用基因枪微弹轰击转化