玉米光敏色素A1基因(ZmPHYA1)在棉花中的转化及分子鉴定

为评价玉米ZmPHYA1基因在棉花种质资源改良中的价值,本研究利用农杆菌介导法在陆地棉(Gossypium hirsutum)R15材料中进行了玉米ZmPHYA1基因的遗传转化。经过愈伤组织诱导、抗性愈伤筛选、体细胞分化诱导后获得棉花转基因再生植株。通过田间草铵膦除草剂筛选鉴定抗性植株,并利用PCR扩增其草铵膦抗性基因和目的基因ZmPHYA1进行分子鉴定,发现阳性植株对草铵膦除草剂具较好抗性,并可扩增到256 bp的草铵膦抗性基因和217 bp ZmPHYA1基因的特异条带。进一步通过免疫印迹检测表明,3个不同转基因株系中外源ZmPHYA1基因可正常表达约170 kD大小的蛋白,且在不同组织中该外源蛋白均可正常表达。此外,对转基因植株的不同农艺性状分析表明,转基因株系株高明显低于受体对照,而铃重和纤维长度等性状无明显差异。本研究成功获得具有草铵膦抗性和外源ZmPHYA1基因的棉花新种质材料,为进一步利用光敏色素基因创新种质资源提供了材料来源。     

Bar基因的亚麻花粉管通道法转化

[研究目的]为鉴定T1代转基因亚麻植株中抗除草剂基因(bar)整合是否成功。[方法]通过花粉管通道法将bar基因导入转化植株,以叶片涂抹法对T1代转化植株进行田间草丁膦最低致死浓度筛选;以最低致死浓度草丁膦进行田间喷施后筛选耐受草丁膦药液的抗性植株,并用PCR检测bar基因阳性的抗性植株数目。[结果]草丁膦对T1代转化植株的最低致死浓度为100 mg/L。得到耐受草丁膦药液的抗性植株44株,PCR检测结果表明,8株为PCR阳性植株,平均转化率为18.2%。[结论]花粉管通道法将bar基因成功转入亚麻基因组。     

将拟南芥ATNCED3基因导入玉米自交系的研究

采用花粉管通道法将ATNCED3基因转入优良玉米自交系昌7-2,在T0代植株三叶期喷洒浓度为200mg/L草铵膦除草剂进行抗性筛选,共得到5株草铵膦抗性植株。对这5株草铵膦抗性植株进行PCR、PCR-Southern及RT-PCR检测,结果表明5株均为阳性植株,初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中,并得到表达。在干旱条件下初步比较了对照和转基因株系叶片的相对含水量、脯氨酸含量,相对电导率等生理生化指标,结果表明,转基因株系各种指标均好于对照,暗示其抗旱性有所提高。     

Bt基因转化玉米培育抗玉米螟自交系

采用基因枪法将苏云金杆菌(简称Bt)的杀虫毒蛋白基因(CryIA)导入东北春玉米自交系铁7922的幼胚中,诱导愈伤组织.抗虫基因的表达载体是pBI121,包含Bt杀虫毒蛋白基因和新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因,筛选标记bar由CaMV 35S启动子驱动.通过对后代植株的除草剂草丁膦(PPT)筛选、分子鉴定和ELISA法检测,证明外源基因已经整合到玉米基因组中并可以稳定遗传.对转基因株系进行田间接玉米螟虫卵,调查不同生长时期的危害指数,最终筛选出一批抗玉米螟自交系.     

抗除草剂转基因玉米快速有效鉴定方法的建立

以含草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyl transferase gene,bar)为筛选标记的抗除草剂转基因玉米为研究材料,通过叶片喷雾法和叶片离体平板培养法试验,建立快速有效鉴定转基因玉米的方法,并探索可有效区分转化和非转化植株的筛选剂剂量。研究结果表明:这两种方法都能快速、有效、方便地鉴定抗除草剂转基因玉米;2000mg/L草铵膦叶片喷雾和培养基中含有5mg/L草铵膦叶片离体培养可快速有效区分是否转入bar基因。通过Bar试纸条分子检测法验证了该鉴定方法的准确性。该鉴定方法的建立为快速有效的筛选大量转基因材料节约大量时间和经费。本研究建立的鉴定方法在转基因材料鉴定和转基因安全评估中具有重要意义。     

抗除草剂草丁膦转基因玉米后代筛选方法的研究

Bar基因作为除草剂筛选标记基因具有高效、快速、简便等优点。为高效筛选转基因玉米阳性植株,加快转基因玉米纯合速度和回交转育速度,本试验以郑58自交系及其转基因后代种子为材料,优化了筛选抗草丁膦转基因玉米的方法。研究结果表明,当草丁膦浓度为30mg/L时,利用浇灌的方法可以高效地淘汰大量非转基因植株和Bar基因表达量低的株系或个体。此方法具有筛选效率高、不受环境因素影响等优点,目前已运用此方法,成功地对大量玉米转基因后代进行了筛选。     

ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究

构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178.收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株.并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论.     

农杆菌介导的RNAi CP基因在大豆中的转化

花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆主要病害之一,生产上常采用种植抗性品种方法来防治。本研究以RNA干扰花叶病毒衣壳蛋白(coat protein, CP)基因为表达载体,Bar基因作为筛选标记基因,成熟子叶节为外植体,采用农杆菌介导法获得了22株T₀代转基因大豆生根苗,经草丁膦涂抹、Bar试纸条和PCR法鉴定,获得RNAi CP转基因植株18株;对转基因植株T₁代的遗传分析表明,外源基因能够稳定遗传到下一代且符合孟德尔遗传规律;T₁代Southern杂交表明,导入的干扰片段为单拷贝;花叶病毒摩擦接种表明RNAi CP转基因大豆植株具有抗花叶病毒特性;摩擦接种后3周,DAS-ELISA检测进一步表明,RNAi CP转基因植株花叶病毒检出率仅为7.69%,而非转基因植株为100%。这表明RNAi花叶病毒CP基因可用于抗大豆花叶病毒的研究。     

CspB基因植物表达载体的构建及转化玉米自交系的研究

利用来自Bacillus subtilis细菌的CspB基因(Gene ID:936224)构建了Ubiquitin启动子驱动的CspB基因植物表达载体PBPC-CspB-bar,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的表达载体转化到玉米自交系京501、京517和吉444,通过喷洒除草剂筛选得到60株草丁膦抗性植株,用PCR检测得到48株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行CspB基因PCR鉴定,获得13株同时整合CspB和bar的转基因株系。     

BADH基因转入玉米自交系的研究

采用花粉管通道法将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)转入玉米自交系京24,以提高玉米的耐盐性。在玉米植株T0代喷洒200mg/L草铵膦除草剂进行抗性试验,获得4株抗性苗。在T0代进行PCR初步检测得到3株转基因植株。在T2代通过Southern blotting以及Northern blotting检测,表明外源BADH基因已经整合并表达。对T2代株系和京24自交系(CK)在高盐胁迫下进行相对含水量、叶片电解质外泄率、甜菜碱含量、脯氨酸含量等生理指标的测定,结果表明转基因株系的生理指标明显好于对照,说明转入BADH基因能提高玉米的耐盐性。