对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定

采用12个3''锚锭引物和8个5''随机引物构建引物组合, 运用DDRT-PCR差异显示方法, 分析NCo376和F134两品种接种黑穗病菌前后的基因表达差异。经克隆、测序和半定量RT-PCR验证, 获得7条真实差异表达片段, 这些片段分别同GenBank中编码细胞色素C氧化酶基因、核糖体蛋白基因、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶基因、氨基转移酶基因、乙烯响应相关结合蛋白基因、RNA聚合酶特异转录起始因子和反转录转座子的序列的同源性达28%~99%。半定量RT-PCR分析表明, 细胞色素C氧化酶基因的表达受甘蔗黑穗病菌和水杨酸的调控, 不依赖于过氧化氢的作用机制, 在甘蔗根、茎、叶中表达的抗病基因组成型表达, 但表达水平较低。推测甘蔗受黑穗病菌侵染后, 可能通过细胞色素C氧化酶基因的诱导, 促使植保素合成增多, 以此抵抗或抑制病原菌的胁迫。该结果丰富了甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制研究, 为甘蔗抗黑穗病分子育种奠定了基础。     

甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种后代鉴定系列研究Ⅲ.甘蔗斑茅远缘杂交后代细胞遗传分析

以甘蔗与斑茅杂交和回交后代为供试材料，进行染色体计数与核型分析，结果表明，在5个供试材料中，海南斑茅92-105的体细胞染色体数2n＝60=60m，属原始的1A型染色体，其他材料的核型均属2B型。以拔地拉（2n=80=70m+10sm）为母本、海南斑茅92-105为父本的杂交后代崖城96-66的体细胞染色体数目为2n=70=68m+2sm；以崖城96-66为母     

甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种后代鉴定系列研究(二):甘蔗斑茅远缘真实杂种的分子鉴定

根据斑茅ITS区序列设计编号为EF1／ER1和编号为EF2／ER2的两对引物,经在甘蔗及其近缘属植物间ITSPCR扩增,证明这两对引物是斑茅特异引物,其中引物EF1／ER1在斑茅多态性研究中扩增出5种带型,而引物EF2／ER2扩增出3种带型;同时,利用这两对引物对甘蔗(拔地拉)与斑茅杂交的9个F1,甘蔗斑茅真实杂种(崖城96-66、96-46)与CP84-1198的36个BC1以及崖城95-41与内江57-416的12个BC1,15个曾被认为具有斑茅血缘的品系进行分子鉴定,结果表明,两对引物的鉴定结果基本一致,其中对斑茅F1的分子鉴定结果与前人(沈万宽)的同工酶鉴定结果相一致,对15个曾被认为具有斑茅血缘的品系进行鉴定结果显示大部分品系为假杂种。     

甘蔗与斑茅杂交染色体组构成特征研究

斑茅是甘蔗重要的野生种质资源,渗入斑茅血缘来提高甘蔗抗性是目前甘蔗育种的重要途径之一。对甘蔗与斑茅杂交后代进行染色体分型有利于高效利用斑茅的各种优异性状。本研究利用斑茅特异引物鉴定斑茅与甘蔗杂交高世代材料的真实性,通过荧光原位杂交对甘蔗与斑茅染色体进行分型,以探究斑茅和甘蔗染色体在子代中的遗传与分离,并分析其染色体组结构特征。结果表明,杂交群体中有30份为斑茅的真实后代,包含斑茅染色体从1～10条不等,说明其后代群体基本服从n+n的遗传方式,占整个真实后代群体的60%。斑茅与甘蔗发生染色体水平的重组约16.67%,并且斑茅与不同血缘甘蔗重组的概率趋近一致。割手密种特异探针共定位结果表明,斑茅血缘的渗入降低了近现代栽培甘蔗种中热带种血缘与重组血缘的占比,并同时提高了割手密血缘的比例。本研究分析的甘蔗与斑茅杂交后代中不同血缘染色体组的遗传及结构特点,为提高斑茅种质资源在甘蔗育种中的开发利用提供了细胞遗传学基础。     

不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物与甘蔗互作防御酶差异的研究

为研究来源于不同遗传类群甘蔗黑穗病菌分离物侵染寄主甘蔗防御酶活性变化差异,采用注射接种法,将5个不同遗传类群的代表分离物(分离物编号依次为16,24,25,47,89号)侵染抗病甘蔗品种Q171和感病甘蔗品种ROC22,测定甘蔗与甘蔗黑穗病菌分离物互作过程中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果表明:5株分离物侵染引起的寄主甘蔗SOD、POD、CAT活性变化曲线中均存在2个酶峰值,抗病甘蔗品种Q171中PPO和感病甘蔗品种ROC22中PAL也存在2个酶峰值,接种后1 d出现峰值Ⅰ,接种后3~5 d出现峰值Ⅱ。其中峰值Ⅱ时期,5株分离物侵染的甘蔗上述5种防御酶活性均高于对照,但不同分离物侵染的甘蔗SOD、POD、PAL活性的峰值Ⅱ大小及出现时间表现出差异,尤其是89号分离物峰值Ⅱ比其余4个分离物峰值Ⅱ出现时间提早1~2 d且峰值差异明显。初步认为89号分离物可能代表着与其他分离物不同的致病型生理小种。     

cDNA芯片检测棉花纤维发育相关基因的表达

利用cDNA芯片技术分析E6、Lipid transfer protein(LTP)、Proline-rich protein(PRP）、Expansin、Tubulin、Annexin等家族的63个棉花纤维发育相关基因,在陆地棉徐州-142开花后10d纤维组织及其无长绒无短绒突变体开花后10d胚珠中的表达差异,发现属于E6、LTP、PRP、Expansin家族的基因在两种组织中存在显著的表达差异,符合前人的报道。其中E6、LTP家族的基因在两种组织中的表达差异最大,个别基因表达差异甚至达到15倍之多。而Tubulin家族的基因在两种组织中的表达差异不大,检测的24个Tubulin家族基因中,仅2个基因在纤维组织和胚珠中存在显著表达差异。cDNA芯片技术可以高通量鉴定棉花纤维相关基因以及研究棉花发育相关基因的表达谱。     

高粱响应丝黑穗病侵染的转录组分析

高粱是中国重要的粮食作物,用途非常广泛。丝黑穗病在中国的高粱产区均有发生,已成为影响中国高粱生产最重要的病害。本研究采用高通量测序技术对被丝黑穗病病菌侵染的抗感病高粱进行转录组测序,筛选得到差异基因620个,其中229个上调表达,391个下调表达。差异基因中有330个获得GO数据库功能注释,主要涉及生物合成过程、催化活性、细胞过程等诸多生理生化过程;KEGG数据库富集分析发现,共有105个基因被注释到52个代谢通路中,其中类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、二苯乙烯、二庚烷和姜辣素的生物合成、植物激素信号传导、苯丙氨酸代谢、植物病原互作、类胡萝卜素生物合成、油菜素内酯生物合成等通路显著富集。有26个差异基因被鉴定为转录因子,分布在10个转录因子家族中。RT-qPCR验证了高粱中差异基因的表达量变化趋势与转录组测序分析结果一致。本研究结果表明,在抗病高粱响应病原菌侵染的过程中,大量基因被诱导或抑制表达,与病原胁迫响应有关的部分转录因子显著上调表达,抗病相关的代谢和信号传导途径被激活。本研究为进一步挖掘高粱抗病基因提供参考。     

含斑茅血缘的甘蔗回交后代遗传多样性SSR分析

利用SSR分子标记对44个含斑茅血缘的甘蔗回交后代和38个常规甘蔗栽培种进行遗传多样性分析。结果显示,在80对SSR引物中筛选出17对扩增带型清晰、多态性较好的引物,共扩增出40条多态性条带,每对引物的扩增条带数介于1～5条之间,平均2.4条。引物检测到的有效等位基因数(Ne)介于1～3.1,平均值为1.809 8;多态性信息量(PIC)介于0～0.611,平均值为0.307 9;Shanoon指数(I)介于0～1.238 2,平均值为0.591 2;Ne's基因多样性指数(H)介于0～0.677 8,平均值为0.357 4。82份试验材料之间的遗传相似系数介于0.425～0.975之间,平均值为0.679,含斑茅血缘甘蔗回交后代品系间的平均遗传相似系数为0.700,常规甘蔗栽培种间的平均遗传相似系数为0.673,而含斑茅血缘甘蔗回交后代与常规甘蔗栽培种间的平均遗传相似系数为0.666。采用非加权组平均法(UPGMA)聚类分析表明,在遗传相似系数为0.59处,所有材料被划分为2个类群,‘台糖95-8899’独成一类,其他81个材料划分为另外一个类群,定为A类群;在遗传相似系数0.612处,A类群被划分为2个亚类群,‘崖城03-191’独成一类,其余80个材料划分为另外一个亚类群。本研究基于SSR分子标记技术,揭示了含斑茅血缘的甘蔗回交后代的遗传多样性,为含斑茅血缘的甘蔗回交后代的杂交利用提供了一定的参考依据。     

具有斑茅种质的耐旱甘蔗品系的选育

经过固定光照(12h, 25min)和随后的递减光照(递减率15s或30 s/d)等处理, 诱导甘蔗属热带种的Badila、 IJ76-315等品系和甘蔗属中国种的广东竹蔗、江西竹蔗等品系开花, 用作母本; 采取调整种植期、剪叶等措施, 延迟甘蔗属的割手密和蔗茅属的斑茅开花, 用作父本. 实施热带种与割手密, 热带种与斑茅, 中国种与割手密, 中国种与斑     

用基因组原位杂交方法分析甘蔗-斑茅杂种及回交后代的染色体组成

斑茅(Erianthus arundinaceus Retz)是甘蔗的近缘属植物,具有多种优良特性,是甘蔗育种的重要种质资源之一。本实验使用基因组原位杂交(GISH)技术分析了甘蔗-斑茅杂种及回交后代F1、BC1和BC2的染色体构成与传递行为。结果表明:在F1代,来自斑茅HN92-77的染色体数目介于28～30条,来自热带种Badila的染色体数目介于38～40条,体细胞染色体数为2n=68～70,基本符合n+n的染色体传递方式;在BC1和BC2代,来自斑茅的染色体数分别为22～28条和13～15条,来自甘蔗的染色体数分别是87～94条和98～101条,其体细胞染色体数2n分别为110～121条和112～115条,基本上分别符合2n+n和n+n的染色体传递方式。在所观察的渐渗系中,均存在有染色体丢失的现象,但未观察到染色体发生交换与重组。     

cDNA微阵列鉴定差异表达基因的可靠性分析

应用马铃薯晚疫病水平抗性相关的1 009条表达序列标签(ESTs)所制备的cDNA微阵列和荧光信号Cy3,Cy5杂交系统,通过同一样品RNA的自身比较试验及与不同样品RNA的差异分析试验,对该技术的重复性和可靠性进行了验证分析。结果表明,在自身比较试验中,芯片杂交的假阳性率仅为0.79%,相关系数高达0.981 1;在差异分析试验中,同向标记、正反向标记、同一芯片内2个重复杂交结果的相关系数分别为0.966 0,0.889 5,0.980 2。研究结果证实,cDNA芯片技术具有高度的可靠性,可以鉴定出显著差异表达基因,并构建高质量的基因表达数据库,通过3次生物学重复和2次技术重复试验(采用正、反向标记)即可克服绝大部分试验误差。     

香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定

抑制差减杂交技术(suppression subtracfive hybridization,SSH),是抑制PCR与差减杂交技术相结合而产生的。其优点是在差减杂交过程中使不同丰度cDNA的拷贝数差异趋于均衡,因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆,能有效分离低丰度的差异表达基因,避免了表达序列标签分析中高丰度基因重复测序的缺点。因此SSH技术被应用于植物差异表达基因的分离。香蕉果实采后成熟过程中发生一系列复杂的生理变化,这些变化涉及到许多基因的表达。为了研究香蕉果实采后与采前在基因表达上的差异,我们首次采用抑制缩减文库的方法,以分离香蕉果实在采后表达的基因。以采后0h的香蕉果实cDNA为驱动子,对香蕉果实采后48h果实cDNA为待测子,进行抑制缩减杂交,抑制缩减杂交产物与pGEM—TEasy Vecter连接,转化E．coli DH5α,构建了抑制缩减文库。该文库共包含312个克隆,采用PCR方法对文库进行了重组子的鉴定,共有302个重组子。该文库的构建成功为深入研究香蕉果实采后基因的表达奠定了基础,为研究香蕉果实采后成熟的分子生物学机理提供了一个新的思路。     

宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的cDNA-SCoT分析

宿根矮化病是危害严重的世界性甘蔗主要病害之一,为了探究甘蔗在该病胁迫下的抗病分子机制,本研究以甘蔗品种新台糖22健康植株为材料,利用含有宿根矮化病病原菌的蔗汁诱导其抗性,分别在接种后2、4、6、8和10 d取样,构建宿根矮化病侵染处理与对照的RNA混合池,利用cDNA-SCoT法进行差异显示研究。结果表明,80条SCoT引物扩增出500多条带,长度在100~1800 bp之间。从中筛选出30个差异明显的条带,测序后序列拼接,获得22条高质量的EST序列。生物信息学分析显示,对甘蔗宿根矮化病的差异基因主要涉及能量代谢、防卫反应、信号转导、蛋白质类代谢等方面。进一步基因功能分析显示,油菜素内酯合成蛋白、NBS-LRR类抗性蛋白、茉莉酸诱导蛋白、α-微管蛋白、ABA胁迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻译起始因子eif-2b α亚族等可能参与了甘蔗宿根矮化病病原菌互作的过程。     

利用抑制差减杂交技术分离棕色棉纤维特异表达基因

采用棕色棉新彩棉5号为Tester,其白色近等基因系NIL-C5为Driver,通过抑制差减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个棕色棉纤维色素差异表达基因差减文库.从文库中随机挑选400个克隆,将这些克隆的PCR产物点膜进行反向Northern杂交检测,挑选20个差异明显的克隆进行序列分析,结果表明:有5个cDNA片段与已知的功能基因序列相似,其中1个cDNA片段与合成色素的重要酶基因4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)基因有较高的同源性,其它cDNA片段在数据库中未找到同源序列.     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析

菌核病是油菜主要病害, 至今尚未在油菜及相关植物中找到抗性基因。本研究利用qRT-PCR法比较了抗病品种宁RS-1和感病品种APL01在接种核盘菌后0~48 h内11个防御相关基因的表达差异, 以揭示抗病品种宁RS-1的抗病机制。结果表明, 4个基因(PGIP、Cu/ZnSOD、OXO和GLP)在核盘菌诱导前后抗、感品种内表达量均较高, 且抗病品种的表达量显著高于感病品种, 尤其是PGIP基因, 抗病品种宁RS-1在24 h的表达量为诱导前的170.4倍, 而感病品种仅为诱导前的3.5倍, 该时期抗病品种PGIP的表达量为感病品种的1299.4倍;2个基因(LOX2和PDF1.2)在诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 但抗、感品种间表达量差异显著;5个基因(FeSOD、PAL、EDS1、PR1和EIN3)诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 且抗、感品种间的表达量差异不显著。推测抗病品种宁RS-1对菌核病的抗性可能是由于PGIP的上调表达, 抑制了核盘菌PG蛋白对侵染部位油菜组织细胞壁的降解, 从而抑制了油菜菌核病的发生与蔓延。     

甘蓝自交不亲和基因MLPK与SSP的FISH定位

利用FISH技术, 对自交不亲和基因MLPK与SSP在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种分辨率水平的靶DNA载体上进行物理定位。结果表明, 在有丝分裂前中期, MLPK探针信号位于一对近中着丝粒同源染色体的短臂中部, 距着丝粒的百分距离约为53.41±3.16;SSP探针信号位于一对具有随体的近端着丝粒同源染色体的长臂端部, 距着丝粒的百分距离约为78.36±4.26。综合3种载体上的FISH结果表明, MLPK与SSP在甘蓝染色体组中可能都只有一个同源序列座位, 具有在单倍体基因组中的单拷贝性。重复FISH杂交表明, MLPK与5S rDNA位于同一对染色体。依据Armstrong的核型分析标准, 初步判断MLPK与SSP分别位于甘蓝的2号和7号染色体, 与S位点不存在连锁关系。另从比较基因组学角度对定位结果进行了讨论。     

烟草表达抗病基因同源物(RGAs)的鉴定及RGA-SSR标记的开发

烟草是研究植物与病原菌互作的理想材料。鉴定烟草抗病基因及其同源物对揭示抗病机制具有重要意义。近年来公共数据库不断增长的EST序列为烟草表达RGA的鉴定提供丰富的数据。本研究通过拼接GenBank收录的412 325条烟草EST序列,获得149 606条Uni-EST序列。随后利用已克隆的112个植物R基因蛋白序列对其扫描,检测出1113个NtRGA,其中有273、546、53、102和30个分别包含NBS-LRR、LRR-PK、LRR、PK和Mlo结构域,另有109个未检测到结构域。通过序列比对将1071个NtRGA定位于N. benthamiana基因组712个位点上。经搜索,从72个NtRGA中检测出78个SSR,根据其侧翼序列设计64对引物。54对成功从烟草基因组DNA中扩增出清晰条带,9对在24个普通烟草品种间检测出多态性,检出等位基因数2~4个,平均2.56个;41对在6个烟草种间检测出多态性,检出等位基因数2~4个,平均2.61个。     

自花授粉诱导的甘蓝功能基因BoSPI的克隆与表达分析

自交不亲和性是甘蓝在长期进化过程中形成的防止自交衰败、促进杂交优势的一种复杂而完善的遗传机制。克隆自交不亲和性相关基因对甘蓝自交不亲和性的深入研究和利用有重要意义。本研究通过挖掘0~60 min自花和异花授粉的甘蓝柱头转录组数据, 筛选到一个受自花授粉诱导上调表达的基因, 命名为BoSPI。BoSPI开放阅读框534 bp, 编码177个氨基酸, 理论等电点为4.21, 不包含信号肽和跨膜区, 含有4个保守的EF-hand结构域。BoSPI基因起始密码子上游2000 bp的核苷酸序列中含有真菌诱导响应、代谢调节以及器官形成等应答元件。BoSPI基因在大肠杆菌中可诱导表达为17 kD的蛋白。BoSPI在柱头中表达量最高, 在花瓣、萼片、叶片、雄蕊表达量较低。BoSPI蛋白被定位在细胞膜和细胞质。自花授粉30 min后对BoSPI基因的诱导表达显著增强。表明BoSPI参与了柱头响应自花花粉刺激的分子过程, 可能是实现甘蓝自交不亲和性相关的某种新功能基因。     

野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlWE29分子标记定位

小麦白粉病是严重影响小麦生产的重要病害之一,培育和应用抗病品种是有效控制和减少病害的最经济有效的方法。野生二粒小麦是硬粒小麦和普通小麦的四倍体野生祖先种,是小麦抗病性遗传改良的重要基因资源。本研究利用来自以色列的野生二粒小麦WE29与普通小麦杂交,再用普通小麦连续回交和自交,育成高抗白粉病(Blumeria graminis f. sp. tritici)小麦新品系3D258(系谱为燕大1817/WE29//5*87-1, BC₄F₆)。将3D258和高感小麦白粉病的普通小麦品种薛早配制杂交组合,对其F₁、F₂代分离群体和F₃代家系进行白粉病抗性鉴定和遗传分析。结果表明3D258携带抗白粉病显性单基因,暂命名为MlWE29。利用集群分离分析法(BSA)和分子标记分析,发现6个SSR标记(Xgwm335、Xgwm213、Xgwm639、Xwmc415、Xwmc289和Xwmc75)和5个EST-STS标记(BE494426、BE442763、CD452476、BE445282和BE407068)与抗白粉病基因MlWE29连锁。利用中国春缺体-四体系、双端体系和缺失系将抗白粉病基因MlWE29标记物理定位于5BL染色体的0.59–0.79区域。这一普通小麦抗白粉病种质资源的创制及其连锁分子标记的建立为小麦抗病基因分子标记辅助选择、基因积聚和分子育种提供了新的物质基础。     

小麦自噬相关基因ATG10的克隆及白粉菌侵染诱导的ATG10的表达

细胞自噬是一种保守的真核生物细胞内物质分解和循环利用机制, 在植物生长、发育和逆境响应等过程中均扮演了重要角色。自噬相关蛋白ATG10是参与自噬小体形成的关键因子之一。利用同源克隆方法, 从经白粉病菌诱导48 h的小麦材料92R137/扬麦158⁷中克隆了ATG10基因家族3个成员(TaATG10a、TaATG10b和TaATG10c)。序列特征分析、物种间的比较和进化分析, 以及酵母功能互补实验结果证实, 这3个基因均为酵母ATG10的功能性同源基因。TaATG10a和TaATG10b的基因组序列具有相似的6外显子-5内含子基因结构。RT-PCR分析还发现这2个基因都具有2种可变剪接产物。TaATG10a和TaATG10b的GFP融合蛋白被定位于洋葱表皮细胞的细胞质中。白粉菌侵染能够诱导TaATG10a和TaATG10b表达, 因此推测, 小麦针对白粉菌侵染的免疫反应涉及对TaATG10及其参与的自噬过程的调控, 其调控模式因小麦抗、感白粉病反应、不同类型抗病基因介导的免疫反应和不同遗传背景下的感病反应而差异明显, 说明TaATG10及其参与的自噬过程与小麦-白粉菌互作反应关系的复杂性。从外源激素处理诱导的表达情况还发现, 抗、感白粉病的表型差异可能涉及抗、感材料TaATG10基因对同种激素(SA、乙烯或ABA)信号的不同响应模式。