转录组及代谢组联合解析玉米响应花粒期高温胁迫机制

为了探明我国玉米主要推广品种郑单958、先玉335花粒期高温胁迫下基因表达及代谢物差异,挖掘玉米响应高温胁迫的关键基因及代谢物,利用Illumina HiSeq~(TM) 2500高通量测序技术分别对郑单958、先玉335高温胁迫7,14 d的穗位叶及对照叶进行高通量转录组测序,利用广泛靶向代谢组测序技术对样品进行高通量代谢物测序。转录组测序共获得214.81 Gb干净序列。郑单958高温胁迫7 d后检测到49个差异表达基因,其中24个为上调基因。继续高温胁迫14 d共检测到306个差异表达基因,其中130个为上调基因。高温胁迫7 d与高温胁迫14 d对比组中检测到1 462个差异表达基因,其中647个为上调基因。先玉335高温胁迫7 d后共检测到381个差异表达基因,164个上调基因。继续高温胁迫14 d后共检测到299个差异表达基因,226个为上调基因。高温胁迫7 d与高温胁迫14 d对比组中共检测到2 481个差异表达基因,其中1 275个上调基因。在郑单958、先玉335高温胁迫7 d后对比组中检测到6 646个差异表达基因,其中3 253个上调基因。在郑单958、先玉335高温胁迫14 d对比组中检测到5 958个差异表达基因,其中3 110个上调基因。代谢物测序共检测到654个代谢物,郑单958高温胁迫7 d后共检测出28个差异代谢物,共注释到5个代谢通路中。高温胁迫14 d后共检测出54个差异代谢物,共注释到13个代谢通路中,其中9个差异代谢物呈上调表达。先玉335高温胁迫7 d后检测出98个差异代谢物,共注释到24个代谢通路中,其中43个差异代谢物呈上调表达。先玉335高温胁迫14 d后共检测出38个差异代谢物,共注释到13个代谢通路中,其中14个上调表达。郑单958高温胁迫7 d与先玉335高温胁迫7 d对比组共检测出144个差异代谢物,共注释到36个代谢通路中,其中81个差异代谢物呈上调表达。郑单958高温胁迫14 d与先玉335高温胁迫14 d对比组共检测出158个差异代谢物,共注释到40个代谢通路中,其中81个差异代谢物呈上调表达。     

转双价抗虫基因BmkIT-Chitinase玉米株系的获得

通过超声波辅助花粉介导法,将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase分别导入以玉米自交系昌7-2及郑58的花粉为受体的不同基因型的自交系中。本研究共处理玉米雌穗1072穗,获得T0代种子1563粒,经卡那霉素初筛,T1代～T4代PCR及SouthernBlot杂交分子跟踪检测共获得20个转化株系,田间抗虫性鉴定表明共有16个转化株系与对照在抗虫性方面有显著差异,且此抗性随着各代稳定遗传。农艺性状调查结果表明,所获得的转基因玉米株系中大部分材料的农艺性状与对照无显著差异,除了N55材料及N20-1材料。N55材料的穗位高度与对照相比略低6±0.5cm,而穗粒数增加75±5粒。而N20-1材料百粒重增加5±0.5g。因此,转入此双价抗虫基因对玉米农艺性状影响不是很大。经过分子检测、田间抗虫性鉴定及农艺性状调查我们最终选育了9个转双价抗虫基因昌7-2自交系优良株系,6个郑58转双价抗虫基因自交系优良株系。     

11个玉米自交系穗部性状的配合力分析

选用国内11个玉米自交系,采用GriffingⅣ双列杂交设计组配出55个杂交组合,对穗粒重、穗长、穗粗等8个穗部性状一般配合力和特殊配合力进行分析,结果表明:穗行数、行粒数、轴粗、秃尖等性状主要由基因的加性效应起作用,穗粒重主要是受非加性基因效应的作用;郑58×5003/412、昌7-2×综31、B73×昌7-2等10个组合的单穗粒重和千粒重的特殊配合力较高;昌7-2、P138、B73、242/B84具有较高单穗粒重性状GCA效应优势;昌7-2和郑58自交系秃尖性状上一般配合力为负数;5003/412、P138、综31具有穗长和行粒数性状GCA效应优势。     

玉米半乳糖代谢相关酶蛋白基因的克隆及表达

随着全球气温的逐年升高,玉米的生长发育在部分地区常遭受高温胁迫危害,严重影响了玉米的产量和品质,而玉米半乳糖代谢相关酶基因的表达又与高温胁迫相关。为了了解玉米半乳糖代谢通路中相关的酶基因的结构及表达信息,在高温胁迫条件下,以具有不同耐受高温胁迫能力的两个玉米品种为材料,基于转录组测序技术,对其花粉细胞中与半乳糖代谢相关基因的结构及表达进行分析。结果显示,克隆得到4个与玉米半乳糖代谢相关的基因,包括2个ATP依赖的6-磷酸果糖激酶基因(zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2)、1个半乳糖异构酶基因(zm-zx-gm)和1个己糖激酶基因(zm-zx-hxk)。这4个基因的cDNA全长分别为2 555 bp、2 775 bp、1 380 bp和2 256 bp,编码蛋白分别含有348、288、370个和407个氨基酸,并进一步对其编码蛋白的理化性质、功能位点及结构作了分析;基因表达分析结果显示,这4个基因在两个玉米花粉细胞中呈现差异表达,以高温敏感材料先玉335为对照,在处理材料中地88中,zm-zx-pfk1基因上调表达,差异倍数高达26.19倍,zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk三个基因下调表达,差异倍数分别为2.86,3.94倍和2.64倍;KEGG通路分析结果表明,这4个基因的表达产物都参与了半乳糖代谢,zm-zx-gm基因编码的酶催化D-半乳糖转化为α-D-半乳糖;zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2基因编码的酶催化D-塔格糖-6磷酸转化为D-塔格糖-1,6-二磷酸;zm-zx-hxk基因编码的酶催化α-D-葡萄糖(α-D-Glucose)转化为α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-Glucose-6 P)。     

玉米雌穗发育杂种优势相关miRNA的研究

杂种优势已广泛应用于玉米育种, 在提高玉米产量、品质以及增强抗逆性等方面起到了重要的作用, 然而杂种优势的分子机制尚不清楚。植物miRNA主要在转录和转录后水平调节基因的表达。为阐明miRNA是否及如何对玉米雌穗发育杂种优势产生影响, 本研究对玉米杂交种郑单958及其亲本自交系(昌7-2和郑58)进行了高通量miRNA测序和降解组测序。取玉米雌穗花序分生组织(IM)发育为成对小穗分生组织(SPM), 进而产生小穗分生组织(SM), 及小花分生组织(FM)将3个不同时期的雌穗样品用于miRNA建库测序, 鉴定出16个miRNA家族中的81个保守miRNA为非加性表达, 认为是与雌穗发育杂种优势形成相关的miRNA; 3个阶段中分别检测到80.30%、56.06%和48.10%的非加性表达的miRNA被显性或超显性抑制。鉴定出8种新的miRNA, 属于7个miRNA家族。通过雌穗降解组测序, 发现在郑单958及其亲本自交系中共同检测到的miRNA靶向42个基因的82个转录本。根据测序结果构建了miRNA参与玉米雌穗杂种优势的模型, 并推测在雌穗发育早期阶段杂交种雌穗的miRNA的普遍抑制导致其靶基因上调表达, 随着发育进程miRNA逐步解除抑制, 带来其靶基因表达量的逐步减少, 这种miRNA与其靶基因的拮抗关系也许与玉米雌穗发育杂种优势形成有关。     

玉米自交系主要数量性状配合力及利用潜力分析

采用NCⅡ遗传交配设计,对16个玉米自交系的单株粒重等15个性状的配合力进行了分析。结果表明：所测各性状配合力在P1、P2组内不同自交系间存在显著或极显著差异。P1组亲本配合力总效应大小顺序为：ZＫ01-1＞ZＫ01-2＞郑58＞9058＞248＞ZＫ01-3＞齐319;P2组亲本配合力总效应大小顺序为昌7-2＞ZＫ02-2＞ZＫ02-1＞LX9801＞永35-2＞H21＞ZＫ02-4＞ZＫ02-3＞黄早4。郑58改良系ZK01-1、ZK01-2在玉米育种中有较大利用价值;昌7-2改良系ZK02-2、ZK02-1在玉米育种中有较大利用价值。行粒数和粒长是决定玉米产量的主要因素,在玉米育种中应作为优先考虑的性状。     

基于转录组测序筛选黄牛低氧适应性相关差异基因

为探明藏黄牛对低氧适应的相关差异表达基因并分析差异表达基因功能和代谢通路,以藏黄牛和三江黄牛心脏组织为研究对象,提取总RNA,建立测序文库后利用Illumina HiSeqTM 4000进行测序,经生物信息学分析筛选出差异表达转录本,并对差异表达基因进行GO富集和KEGG通路分析,最后采用荧光定量PCR(RT-qPCR)验证测序数据的准确性。结果表明:藏黄牛相比于三江黄牛得到显著差异表达基因608个,其中上调基因467个,下调基因141个,推测表达量较高的B2M、COX7C、NFATC1、ECE1、CAST基因是与低氧适应性相关的基因;差异转录本GO功能富集分析可知,在分子功能、细胞组分、生物过程分别富集到327,253,2 191个条目,其中富集程度最高的条目分别是细胞发育过程、结合与转录因子活性、细胞前缘。KEGG分析结果表明,差异转录本显著富集在8条通路,筛选低氧适应性候选基因NFATC1是MP-PKG信号通路与T细胞受体信号通路成员,推测其通过cGMP-PKG通路与T细胞受体信号通路参与低氧适应性调控。采用高通量测序技术对藏黄牛和三江黄牛心脏组织进行转录组测序分析,获得大量差异表达基因,为研究动物低氧适应性机制奠定基础。     

PEG胁迫下玉米转录组差异性分析

为了明确玉米响应PEG胁迫的关键表达基因,比较PEG胁迫下玉米基因表达的差异,本实验利用RNA-seq对正常灌溉和干旱胁迫的玉米进行转录本测序和数据分析,共获得12358个差异表达基因,其中5275个基因为上调表达,7083个基因为下调表达。对差异表达基因进行COG功能分类,共得到23个不同的COG功能,其中翻译后修饰,蛋白质转换,伴随蛋白681个,占7.74%;信号传导机制功能有转录本675个,占7.67%;转录506个,占5.75%。KEGG通路显著富集到光合作用-天线蛋白、光合生物的固碳作用、卟啉和叶绿素代谢、脂肪酸降解、精氨酸和脯氨酸代谢、磷酸肌醇信号等生命代谢途径。     

玉米ERD基因的表达模式及ZmERD6基因的抗旱性分析

为了进一步了解玉米ZmERD基因,基于旱胁迫转录组数据,筛选出5个ZmERD基因。将这些基因编码的蛋白质与拟南芥16个ERD蛋白进行进化分析发现,GRMZM2G181206和GRMZM2G128641基因编码的蛋白质分别与AT4G02900和AT1G32090基因编码的蛋白质同源性较高。时空表达分析发现,GRMZM2G109201、GRMZM2G181206和GRMZM2G12864基因属于组成型表达,GRMZM2G134192基因属于特异型表达,只在花药中高表达。属于ERD6亚家族的GRMZM2G109201基因在旱敏感型(B73)和抗旱型(郑58)自交系中均表达,且郑58中表达量显著高于B73;随着旱胁迫时间的延长,GRMZM2G109201基因在B73中表达量差异不显著,但在郑58中表达量升高幅度达到显著水平。亚细胞定位显示,GRMZM2G109201基因编码的ZmERD6蛋白定位于质膜。推测GRMZM2G109201基因参与旱胁迫,且被正向诱导。     

活性炭促进玉米幼胚离体培养幼苗生长与发育的转录组分析

以玉米自交系昌7-2为试材,比较了14 d龄幼胚在MS和MSA(MS加活性炭)培养基上离体培养9 d的幼苗生长情况,并利用转录组测序技术分析了2种培养基上的玉米幼苗地上部和地下部的基因表达差异。结果表明,活性炭可以显著促进玉米幼苗的生长与发育。活性炭主要影响地下部基因表达。加入活性炭后,幼苗地下部表达上调的基因有1612个,下调的基因有530个;幼苗地上部表达上调的基因有69个,下调的基因有78个。GO功能显著性分析表明,地下部差异表达基因(DEGs)主要涉及DNA包装、DNA包装复合体和水解酶活性,地上部DEGs主要涉及脂类代谢、胞外区和过氧化物酶活性。KEGG富集分析表明,地下部DEGs主要涉及能量、碳水化合物、脂类和氨基酸代谢,以及细胞周期和植物激素转导途径;地上部DEGs主要涉及泛醌和其他萜-醌类物质合成途径。活性炭促进细胞周期途径中的关键基因(CYC、CDH1、MCM3、PCNA2和BUBR1)、生长素信号传导基因(Aux/IAA)以及细胞色素基因(CYP450)显著上调表达。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证了10个DEGs的表达模式与转录组测序结果一致,证实了转录组数据与分析的可靠性。     

利用WGCNA鉴定玉米非生物胁迫相关基因共表达网络

加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是一种经典的系统生物学分析方法,可用来鉴定协同表达的基因模块,探索模块与目标性状的生物学相关性,并挖掘模块网络中的核心基因。本文收集了低温胁迫、高温胁迫、干旱胁迫和盐胁迫处理下玉米(Zea mays L.)根、茎、叶等组织的58份转录组数据,利用WGCNA方法鉴定玉米非生物胁迫的基因共表达网络模块。过滤转录组数据中12,552个低表达基因后,利用余下27,204个高表达基因构建共表达网络,分析得到25个模块。根据玉米中已报道非生物胁迫相关基因与差异表达基因在模块中的分布,筛选出与低温胁迫、高温胁迫、干旱胁迫和盐胁迫最相关的mediumpurple4、ivory、coral2、darkseagreen4模块和响应多种胁迫的green模块。随后对这5个模块的基因进行GO富集分析,发现在这些模块内与非生物胁迫相关基因的在非生物胁迫调控相关功能显著富集,如胁迫响应、过氧化物酶活性等。对这5个模块作相关性分析,预测出Zm00001eb072870、Zm00001eb32...     

玉米雄穗发育早期耐旱相关转录因子的发掘

为了发掘更多与玉米雄穗生长发育早期耐旱性相关的转录因子基因,选用耐旱型玉米自交系(DT)铁7922、X178,以及干旱敏感型自交系(DS)吉81162和丹340为试验材料。使用盆栽方法进行育苗,并在一致且适宜的肥水条件下培养至雄穗发育前期,通过人工模拟田间干旱胁迫及正常灌溉的方法对材料进行处理。采用RNA-Seq技术检测玉米雄穗发育早期在受到干旱胁迫后相对于正常灌溉处理而言,耐旱相关转录因子家族基因在转录水平上表达量的变化。结果共发现287个转录因子基因在受到干旱胁迫后相对于正常灌溉呈现差异表达。对差异表达基因进行功能富集和注释结果发现,差异表达基因中具有耐旱调控功能的转录因子基因34个。其中在2个耐旱型材料中共有且表达模式一致的基因6个;在2个干旱敏感型材料中共有且表达模式一致的基因3个;在4个材料中均呈显著差异表达的转录因子基因1个。研究结果为玉米雄穗发育早期耐旱功能转录因子基因发掘和耐旱分子育种提供了基因基础。     

稀土镧缓解玉米镉胁迫的生理生化反应及其转录组分析

为了找到玉米缓解重金属镉胁迫的方法,采用稀土镧缓解玉米镉胁迫的生理生化反应,结合转录组分析,研究其缓解机理。试验发现:Cd~(2+)处理会抑制玉米幼苗的根长和地上部分的正常生长,并且这种抑制作用会随着Cd~(2+)浓度的升高而变的愈发明显。低浓度的La~(3+)溶液(10,20 mg/L)会对玉米幼苗的生长产生一定的促进作用,而较高浓度的La~(3+)溶液(40 mg/L)则会对玉米幼苗的生长产生抑制作用。喷施镧溶液会使Cd~(2+)胁迫下的玉米幼苗生长状况得到改善,SOD、POD、CAT的活性与镉胁迫相比显著降低,但是与对照相比还是略高。采用二代测序技术,对镧处理下镉胁迫玉米根部样品进行转录组分析。以单独镉处理为对照,分析其差异表达基因,发现差异表达基因主要富集在淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、苯丙氨酸代谢以及植物激素信号转导4条通路。通过试验得出,喷施镧溶液可以缓解玉米幼苗受到的镉胁迫,但不会使其恢复到正常状态。通过转录组测序推测出稀土缓解重金属胁迫的原因可能与以上4条通路的相关基因有关,为后续针对稀土响应重金属胁迫的相关研究提供了候选分子资源。     

N+离子束注入玉米自交系变异的生物学效应与分子标记分析

采用不同能量和剂量的N+离子束,对郑58、昌7-2和K12玉米自交系的干种子进行处理,结果表明,发芽率、发芽势和农艺性状变异都有很大差异,筛选出的N+离子束注入玉米自交系最佳诱变能量30 KV和剂量7×1016N +/cm2.同时利用10对SSR引物对玉米自交系进行扩增,共检测到39个等位基因,每对引物可检测等位基因2...     

不同分级粒型对玉米自交系种子活力及植株生长发育的影响

选用齐319、9801、昌7-2、郑58和Ph 6 wc 5个玉米自交系不同分级粒型种子为试验材料,通过种子长度、宽度、厚度及千粒重测定、幼苗生长测定、田间出苗率测定以及植株生长发育和成熟有关指标观测,研究不同分级粒型对玉米自交系种子活力及植株生长发育的影响.结果表明:5个玉米自交系4～5种分级粒型(大扁、大圆、小扁、小圆和不分级)中,均以大扁种子活力较高,大多数自交系分级粒型对抽雄盛期、株高、穗位高、开花始期、开花盛期、吐丝初期、吐丝盛期、成熟时间和穗粒数均无显著影响,而对收获种子千粒重均有显著影响.     

高抗旱性二倍体马铃薯材料转录组分析及抗旱基因的初步挖掘

为探究不同干旱胁迫时间处理下，二倍体马铃薯材料对干旱胁迫响应的分子机制，挖掘抗旱相关基因。以高抗旱二倍体资源A90为试验材料，利用转录组测序技术对PEG-6000胁迫下不同时间的差异表达基因进行分析，通过GO富集、KEGG通路分析与转录因子预测参与马铃薯干旱胁迫响应的差异表达基因，初步挖掘抗旱调控关键基因；并通过RT-qPCR对3个抗旱候选基因进行逆境胁迫表达分析。结果表明：A90在20%PEG-6000胁迫处理3,6,24 h与对照相比，共有2 519个差异表达基因，这些基因主要富集在植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等抗旱相关过程中。并且显著富集在通路上的340个共差异表达基因中有53个基因注释到了RLKs、AP2/ERF和Tify等15个转录因子家族中，其中StST/K1、StERF1和StTify1的表达量较高，有可能是抗旱调控关键基因。基因StST/K1和StERF1受到干旱和低温胁迫主要在材料的根和叶中上调表达，基因StERF1在盐胁迫下在材料的根、茎和叶中均上调表达；基因StTify1在受到干旱在材料的茎和叶中上调表达，受到盐胁迫在材...     

硝酸盐胁迫对玉米幼苗氮同化相关酶的影响

为了研究硝酸盐胁迫对玉米幼苗生长相关酶活性的影响,在前人研究工作的基础上以郑58、郑单958和昌7-2为研究材料,采用溶液培养方法,在不同浓度硝酸盐胁迫下,对3个品种的幼苗进行硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、超氧化物歧化酶活性的测定。揭示了玉米幼苗在适宜、高、低浓度硝酸盐供应条件下3种酶活性的变化。结果显示:硝酸盐浓度2.00 mmol/L时,根系和叶片的超氧化物歧化酶活性较低,说明该浓度范围可以作为玉米幼苗适宜培养浓度。低(0.02,0.20 mmol/L)、高(10.00,20.00 mmol/L)浓度硝酸盐条件下,SOD活性明显上升,杂交系郑单958体内SOD活性明显高于亲本郑58和昌7-2品种(P0.05),说明郑单958品种在胁迫条件下有较高的自我保护作用。低硝酸盐浓度(0.02,0.20 mmol/L)时,随着硝酸盐供应浓度的增加硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性增强;高硝酸盐浓度(10.00,20.00 mmol/L)时,硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性下降。叶片NR活性下降程度小于根系,说明硝酸盐供应变化对根系影响较大。父本昌7-2对硝酸盐的还原作用明显弱于母本郑58和子代郑单958,尤其在胁迫条件下存在显著差异(P值均0.05)。谷氨酰胺合成酶的变化趋势与硝酸还原酶活力基本相似。     

高赖氨酸玉米近等基因系创建及胚乳质地变异研究

采用回交转育与分子标记相结合的手段,对育种上广泛运用的3个骨干自交系郑58、478和昌72进行改良,成功创建了高赖氨酸近等基因系。对回交转育成的高赖氨酸近等基因系QZ58、Q478和QC72进行表型分析和研究,结果表明,马齿型的郑58、478和硬粒型的昌72经过相同的转育手段转育成含有o2o2纯合基因型的近等基因系胚乳硬质度发生了很大的变异。从表型来看,QZ58和Q478家系仅有少数几种表现型,而QC72家系却出现了一系列的连续变异。3个骨干系转化前后容重差均值相差很少(郑58与QZ58差均值为107 g／L;478与Q478差均值为105g／L; 昌72与QC72差均值为102 g／L),但降低幅度有很大差异(郑58容重降低幅度为94-147 g／L;478为92-119g／L;昌 72为68-125 g／L),其中昌72的变幅最大。转化后近等基因系胚乳硬质度总体趋势为QC72>Q478>QZ58,与转化前一致。这说明o2基因对不同种质玉米胚乳硬质度降低的总体趋势一致,但效果具有明显差异。     

2种黑籽南瓜响应枯萎病菌侵染的转录组学研究

为了筛选白皮黑籽南瓜和绿皮花纹黑籽南瓜抗枯萎病的差异表达基因，挖掘参与抗性相关的代谢通路。以尖孢镰刀菌侵染2 d后和未侵染的2种幼苗叶片作为材料，利用Illumina Hiseq 2500测序技术进行转录组测序分析。以未侵染的幼苗作为对照，白皮和绿皮花纹黑籽南瓜差异表达基因分别有2082和1116个。其中141个基因在2种黑籽南瓜中均呈现出差异表达，62个基因具有相同表达趋势。对差异表达基因进行GO功能注释，结果显示2种黑籽南瓜差异表达基因主要富集在生物学过程中。KEGG代谢通路分析发现白皮有22个差异表达基因显著富集在植物激素信号通路，绿皮花纹有30个差异表达基因富集在苯丙烷生物合成通路。本研究挖掘出黑籽南瓜抗枯萎病差异表达基因，预测了抗性通路，为瓜类抗病机制的深入研究奠定了理论基础。     

模拟干旱对不同耐性玉米自交系幼苗根系和水分利用效率的影响

以耐旱玉米自交系昌7-2(T)和旱敏感玉米自交系Mo17(S)为试验材料,利用4个水平PEG-6000浓度处理,研究苗期干旱对不同耐性玉米自交系根系形态特性和叶片水分利用效率的影响。结果表明:PEG-6000胁迫下,玉米自交系的根总长、根系表面积、根系体积与根系吸水能力均减小,Mo17的变化幅度大于昌7-2;植株水分利用效率增加,Mo17增加幅度小于昌7-2。与旱敏感玉米自交系相比,耐旱玉米自交系在干旱胁迫下仍能保持较正常的根系形态、较高的吸水能力和水分利用效率。