大白菜细胞质雄性不育的分子鉴定及序列分析

为了获得3种大白菜细胞质雄性不育系Ogu CMS,Pol CMS,CMS96和保持系间的多态性以及定位大白菜CMS96不育系所属的不育类型,利用设计的atp6,orf222单一和混合引物PCR扩增3组11份同核异质大白菜细胞质雄性不育系和保持系mtDNA。结果表明,atp6引物在大白菜Ogu CMS不育系扩增的200 bp片段为其特异带;orf222引物仅在大白菜Pol CMS和CMS96不育系有扩增产物,但二者有3点完全不同:大白菜Pol CMS不育系扩增产物为675bp,CMS96不育系扩增产物为669 bp,二者相差6个核苷酸,后者定名为大白菜CMS96-orf222。大白菜CMS96-orf222与甘蓝型油菜Nap CMS的nad5c基因和Nap-orf222基因同源性均为99%,E值为0.0;大白菜Pol CMS的675 bp序列具有ORF224开放阅读框,没有保守结构域,而大白菜CMS96的669 bp序列具有ORF222开放阅读框和保守结构域YMF19。另外,atp6和orf222混合引物多重PCR扩增产物存在明显多态性:800 bp为大白菜保持系的差异带型;2 300 bp和1 500 bp为大白菜Pol CMS不育系特异带型;200 bp为大白菜Ogu CMS不育系特异带型;690 bp为大白菜CMS96不育系特异带型。该方法仅用一次PCR反应快速地将3种大白菜细胞质雄性不育系和保持系一次性全部区分开,为大白菜分子育种和常规育种更好地相结合提供了简单、快速、准确和重复性好的方法和手段。     

大白菜CMS96细胞质雄性不育分子特性研究

大白菜CMS96细胞质不育系是由大白菜株系与甘蓝型油菜细胞质不育源杂交、多代回交后获得的。该不育系生长势旺、不育性稳定,不育度和不育株率均为100%,蜜腺正常,在大白菜杂种一代生产中具有广阔的应用前景。为了定位大白菜CMS96细胞质不育所属的类型和获得其不育有关的特异序列,依据atp9、coxI、orf138和orf224保守序列设计4对引物,对3组11份大白菜材料线粒体DNA进行PCR扩增,每组材料内包含同核异质PolCMS、OguCMS、CMS96三种大白菜不育系和一种共用保持系。结果表明,atp9和coxI引物在所有材料中均有扩增产物,供试材料间没有差异;而orf138和orf224引物扩增产物存在差异。orf138引物仅在全部OguCMS和CMS96不育系中扩增出309bp特异带,而保持系和PolCMS不育系没有扩增产物;orf224引物仅在所有PolCMS中扩增出689bp特异带,而保持系、OguCMS和CMS96不育系没有扩增产物。同时,对保持系和不育系花组织mRNA进行RT-PCR分析,进一步验证了orf138和orf224引物扩增产物的特异性和一致性。同源性分析结果表明,利用orf138引物所获得的309bp大白菜mtDNA特异片段均与萝卜OguCMS、甘蓝型油菜OguCMS萝卜体细胞杂种所具有的Oguorf138高度同源,二者有172个核苷酸完全相同,有58个氨基酸完全相同;orf224引物所获得的689bp大白菜mtDNA特异片段与甘蓝型油菜的Polorf224高度同源,二者有677个核苷酸完全相同,有225个氨基酸完全相同,同源性均达到100%。初步认为大白菜OguCMS和CMS96不育系具有相似性,OguCMS萝卜所具有的orf138是导致二者不育的原因;Pol甘蓝型油菜所具有的Polorf224是导致大白菜PolCMS不育的原因。     

一种紫色大白菜细胞质不育系的分子鉴定

为了获得紫色大白菜细胞质不育系的特异序列,鉴定该不育系所属的不育类型,应用设计的 orf138上、下游引物PCR扩增6份材料:紫色大白菜CMS不育系,保持系07-721,杂交F1,3个回交BC1单株BC1-1、BC1-2和BC1-3.对获得的差异片段进行克隆、测序,同源性比较.结果表明,在紫色大白菜CMS不育系、杂交F1、3个回交BC1单株上均扩增到309 bp的特异产物,而保持系07-721没有扩增产物.测序和同源性比对结果表明,紫色大白菜CMS的orf138与萝卜Ogura不育系的orf138、芸薹属作物与萝卜Ogu CMS体细胞杂种的orf138同源性均达到99%,E值为2e-155.证明了紫色大白菜CMS不育系为一种改良的Ogura萝卜细胞质不育系,同时初步探讨了该不育系和紫色基因的应用前景.     

油菜胞质不育类型相关基因研究进展

细胞质雄性不育在油菜杂种优势利用中具有重要作用,研究细胞质雄性不育的不育机理对有效利用杂种优势,实现三系配套及创造强优势组合具有重要意义。介绍Ogu CMS,Pol CMS,Nap CMS等目前国际上主要的甘蓝型油菜细胞质雄性不育类型,综述了线粒体基因组上与CMS性状相关基因的位点或片段的最新研究进展,并讨论当今学术界有关CMS产生机理的主要论点。     

大白菜转育新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的研究

用26份不同大白菜株系与甘蓝型油菜细胞质雄性不育材料CMS96进行多代回交转育，成功地转育出5份不同类型的大白菜细胞质雄性不育系（包括桔红心和黄心大白菜株系）。鉴定结果表明，这些不育系材料不育性稳定，不育度100％，不育率100％，蜜腺正常，花药白色退化，植株整齐一致，生长旺盛，是新型的优良大白菜细胞质雄性不育系材料。用其配制的杂交组合，杂种优势明显。     

大白菜CMS96细胞质雄性不育系的特点分析

为了筛选和利用大白菜细胞质雄性不育系,对大白菜的3种细胞质雄性不育系：CMS96细胞质雄性不育系、波里马细胞质雄性不育系(Pol-CMS)和萝卜细胞质雄性不育系(Ogu-CMS)及其相应的保持系进行了主要植物学性状的比较研究。结果表明：Ogu-CMS存在多代转育后植株长势退化、杂交优势差,Pol-CMS存在育性受环境条件影响等缺点,而CMS96细胞质雄性不育系则克服了二者的缺点。另外,CMS96细胞质雄性不育系早期的晚抽薹性比保持系强、杂交种子的产量比保持系杂交种子产量高。CMS96细胞质雄性不育系不仅不育性稳定,多代回交不退化,而且杂交优势强,繁种产量高,表现出了广阔的育种应用前景。     

利用分子标记鉴定白菜细胞质雄性不育类型的研究

通过对9份白菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型进行分子标记鉴定,以期为今后更好的利用分子标记来进行辅助育种奠定基础。通过CTAB法提取白菜的基因组DNA,根据GenBank中orf138基因保守序列设计2对特异引物,对9份白菜基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出条带的PCR产物进行测序,在NCBI中进行同源性比对,最终确定其不育胞质类型。结果表明：2对特异引物PI/PII和PIII/PIV只在4份白菜雄性不育基因中均扩增出条带,在另外5份材料中未扩增出条带,与田间育性鉴定相符,获得4份白菜Ogura胞质雄性不育的分子标记;在GenBank中用BLAST进行同源性比对分析,发现L1-CI、L3-CI、L3-F1 3个不育材料的特异片段与已报道的青花菜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因（Genbank登录号：HQ149728）同源度高达100%,L1-F1的同源度达99%,出现了一个变异位点,另外5份材料的胞质不育类型有待进一步研究。通过该方法鉴定出9份材料中有4份材料是萝卜胞质雄性不育的材料,得到了4条分子标记,该结果可为白菜细胞质雄性不育的分子鉴定提供了新的标记,也为今后利用分子标记辅助育种奠定了基础。     

与大白菜细胞质不育相关RAPD特征片段的克隆和序列分析

为了研究和获得大白菜细胞质不育系和保持系线粒体DNA的多态性,选用153个RAPD随机引物,对3套材料,每套中包含不同来源、同核异质的大白菜细胞质不育系（Pol-CMS、Ogu-CMS和CMS96）和保持系线粒体DNA进行RAPD分析。结果表明,有4个RAPD随机引物可以在全部Ogu-CMS和CMS96不育系中扩增出特异带,有1个随机引物仅在所有Ogu-CMS不育系中扩增出特异带;同时将OPAH16随机引物扩增的与不育相关的特异带进行了克隆和测序。结果表明,所获得的特异片段均与拟南芥和甘蓝型油菜的线粒体基因组序列部分同源,但与已发表的不育基因序列没有同源性。由这5个序列推导出的蛋白质与拟南芥中的一种未知功能蛋白AtMg00760（ORF109b）具有部分同源性。这5个序列的可能功能正在验证中。     

甜菜细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析

本文对甜菜线粒体DNA的提取方法进行了改进,在不需密度梯度离心条件下即可获得高纯度的DNA。优化了甜菜线粒体的RAPD的反应条件,对细胞质雄性不育甜菜的不育系及其保持系的线粒体DNA(mtDNA)进行了RAPD(随机扩增多态DNA,randomly amplified polymorphic DNA)分析,结果表明：甜菜细胞质雄性不育系和保持系线粒体DNA之间存在丰富的多态性。     

大白菜胞质雄性不育线粒体基因特异分子RAPD标记及克隆

用随机引物对大白菜细胞质雄性不育系及其保持系线粒体DNA的RAPD分析,在不育系与保持系的线粒体基因组间存在明显的差异,用引物S259在不育系中扩增并克隆得到特异片断(mt)S259~600bp,序列分析表明该片断与油菜线粒体基因NADH脱氢酶第四亚基序列有部分相似性,片段与雄性不育的关系还需进一步研究。     

甘蓝细胞质雄性不育相关基因orf138的分子特性分析

为了研究甘蓝雄性不育机制,根据萝卜CMS相关基因orf138的序列信息,设计特异引物,并在甘蓝不同类型不育系和保持系中鉴定PCR产物的稳定性。随后利用Tail-PCR技术,扩增获得此基因的侧翼序列并进行了生物信息学分析。结果表明在甘蓝不育型材料中,能够稳定扩增出300 bp左右的单一条带,而在其他细胞质不育类型和可育材料中均未扩出条带,经多次验证结果稳定可靠。甘蓝中orf138的上下游侧翼序列有效碱基1789 bp,通过生物信息学分析,获得包括起始密码和终止密码的orf138的完整序列共417 bp。同源性比对结果显示：与甘蓝型油菜﹑白菜和萝卜的orf138片段具有高度保守性。分析侧翼序列表明甘蓝orf138的3’端是由ORF83、trnfM、ORF125等基因片段构成的一个复杂序列。获得了甘蓝OguCMS特异的分子鉴定标记,明确了orf138在甘蓝线粒体中的位置,以上结果为甘蓝雄性不育的进一步研究奠定良好的基础。     

甘蓝型油菜双低萝卜质不育恢复系快速改良技术研究

通过采取不同的常规育种策略和小孢子培养、分子标记辅助选择等现代生物技术,研究了提高甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系改良效率的方法。结果表明,在甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系杂交转育过程中,采用杂交后代与萝卜质不育系杂交,可使杂交后代分离群体中不具备恢复基因的单株在花期表现出来,无须测交即可进行选择;杂交后代通过小孢子培养,可将稳定纯合时间由传统自交8个世代缩短到3个世代;通过萝卜特异分子标记辅助选择可大大提高选择的精度,减少筛选所需的人力、土地和时间,选择效率提高90%。试验筛选出19个在萝卜质不育恢复系中能够扩增出单一、易于辨别的谱带的SCAR标记引物,其中10个引物在现有的甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系中均能检测出特异标记。筛选出的甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系的特异分子标记与前人研究存在差异,标记相似系数为48.28%~93.10%。通过分子标记无法区分高硫甙和低硫甙恢复系,选育低硫甙萝卜质不育恢复系还需要借助品质分析仪。成功筛选得到6个甘蓝型油菜低芥酸、低硫甙、抗寒、结角正常、农艺性状优良的萝卜质不育恢复系,为将甘蓝型油菜萝卜质不育杂种优势应用于我国油菜生产奠定了基础。