春性甘蓝型油菜BnMQ34基因的克隆及表达分析

克隆春性特早熟甘蓝型油菜苗期表达的基因,并对其表达模式进行研究。用cDNA-AFLP技术筛选苗期特异性表达基因片段,根据差异片段设计特异性引物,用RACE技术扩增差异基因两端序列,并进行全长cDNA克隆。用RT-qPCR法进行表达分析。结果获得了一个苗期特异表达基因的cDNA全长序列455 bp,该基因编码一个由71个氨基酸残基组成的蛋白。该基因暂命名为BnMQ34。与油菜基因组序列比对结果显示,BnMQ34基因位于C4染色体上,由三个外显子和两个内含子组成。生物信息学分析显示,BnMQ34与甘蓝型油菜和白菜型油菜中报道的未诠释基因XM_013837282.1和XM_009127502.1的相似度达100%。油菜不同发育时期叶片中BnMQ34基因的表达量存在差异,苗期叶片中表达量最高。BnMQ34在春性特早熟甘蓝型油菜幼苗发育中可能起到重要的调节作用。     

初步探究LncRNA在甘蓝型油菜生态型分化中的作用

甘蓝型油菜是我国重要的油料作物之一,根据其成花转变过程中对低温春化时间需求的不同分为3种生态型:春性、半冬性和冬性。前人研究发现,长链非编码RNA (LncRNA)可在多层面上调控基因的表达,参与对植物生长发育的调控。在拟南芥中, LncRNA可以通过调控春化途径相关基因的表达来影响开花。本研究以3种生态型甘蓝型油菜为材料,利用高通量测序技术进行苗期叶片的mRNA和LncRNA测序,初步探究LncRNA在油菜生态型分化及适应性形成中的作用。3种生态型甘蓝型油菜共差异表达基因的GO及KEGG富集分析表明,不同生态型甘蓝型油菜之间存在大量基础化合物合成代谢差异,特别是脂质类化合物。3种生态型甘蓝型油菜中共鉴定获得3775个LncRNA,其中285个在2个及以上生态型组合中存在差异表达,涉及到1517个候选靶基因。这些差异表达LncRNA涉及到的靶基因也富集到大量基础化合物合成代谢途径。通过mRNA-LncRNA联合分析,我们预测到了一个开花基因的调控网络,包含8个开花基因和23个LncRNA,涉及到温度和光信号调控通路。通过比较鉴定得到的LncRNA和972个甘蓝型油菜重要农艺性状QTL位...     

甘蓝型油菜PEBP基因家族的鉴定与表达分析

植物磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingprotein,PEBP)基因对于控制开花时间具有重要作用。油菜作为世界上最重要的油料作物之一,与模式植物拟南芥具有相似的开花习性。但有关油菜开花基因的功能研究相对较少。本研究利用拟南芥PEBP基因家族蛋白序列在油菜基因组内进行BlastP分析,获得油菜PEBP家族成员,并对其进行基因结构分析、motif预测、复制事件、进化树构建、选择压力分析和组织表达分析。结果表明,共有26个油菜PEBP基因成员得到鉴定,大部分成员含有4个外显子和3个内含子, motif-1和motif-2是PEBP成员的特征基序,超过76.9%的成员属于片段复制扩增事件。进化树分析显示, PEBP分为3个亚家族,基于转录组测序的组织表达数据表明油菜26个PEBP成员具有非常明显的组织表达特性。以上研究结果,极大丰富了我们对甘蓝型油菜开花基因及调控模式的认识,为进一步的分子育种提供了理论基础。     

甘蓝型油菜PIN家族基因的鉴定与生物信息学分析

PIN家族基因是一类调控植物生长素极性运输的重要载体元件, PIN基因编码生长素输出蛋白, 介导生长素在植物体的运输, 然而在基因组较复杂的甘蓝型油菜中缺乏系统研究。本研究运用生物信息学方法在甘蓝型油菜全基因组数据库筛选甘蓝型油菜PIN家族基因, 对鉴定出的29个BnPINs基因开展拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、PIN蛋白二级结构及三级结构预测等研究, 结合高通量转录组测序进行低氮胁迫下的转录水平分析。结果表明, 甘蓝型油菜PIN家族基因拷贝数明显多于拟南芥、甘蓝和白菜所具有的PIN家族基因数量; BnPINs蛋白多属于由碱性氨基酸组成的稳定蛋白, 含有保守的N末端结构域, 二级结构与拟南芥PIN蛋白相似; 系统进化选择能力分析表明, BnPINs基因与甘蓝和白菜PIN家族基因进化关系相近。转录组测序表明, BnPIN1s、BnPIN2s、BnPIN3s基因主要在甘蓝型油菜根部表达且受长期低氮(72 h)诱导, BnPIN6s和BnPIN8s基因主要在地上部表达, 低氮会抑制BnPIN6s表达。本研究结果为进一步研究甘蓝型油菜PIN家族基因生物学功能尤其是在响应低氮胁迫中的功能奠定基础, 为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。     

小麦TaFT基因编码区序列多态性及其与开花期的关系

春化基因VRN-B3是小麦开花素基因TaFT,为探索该基因在品种间的保守性及其与小麦开花早晚的关系,根据TaFT基因序列(GenBank accession No.: DQ890162)设计特异PCR引物,扩增了13个品种中该基因的编码区。通过测序和序列比对,发现不同品种间该基因编码区的DNA序列存在多态性,序列翻译发现5个品种的表达产物FT蛋白发生变异。利用中国春的非整倍体材料将TaFT基因定位在7BS染色体上。参考品种的冬春性及开花时间,推测冬性品种正常的FT蛋白(同DQ890162翻译的氨基酸序列一致)可加速开花,FT蛋白变异则延迟开花;春性品种的FT蛋白变异与否对开花期影响不大,推测TaFT基因的效应可能被春性品种的显性春化基因所掩盖。     

小麦TaFT基因编码区序列多态性及其与开花期的关系

春化基因VRN-B3是小麦开花素基因TaFT,为探索该基因在品种间的保守性及其与小麦开花早晚的关系,根据TaFT基因序列(GenBank accession No.: DQ890162)设计特异PCR引物,扩增了13个品种中该基因的编码区。通过测序和序列比对,发现不同品种间该基因编码区的DNA序列存在多态性,序列翻译发现5个品种的表达产物FT蛋白发生变异。利用中国春的非整倍体材料将TaFT基因定位在7BS染色体上。参考品种的冬春性及开花时间,推测冬性品种正常的FT蛋白(同DQ890162翻译的氨基酸序列一致)可加速开花,FT蛋白变异则延迟开花;春性品种的FT蛋白变异与否对开花期影响不大,推测TaFT基因的效应可能被春性品种的显性春化基因所掩盖。     

Bna.C02SWEET15通过光周期途径正向调控油菜开花时间

开花时间是作物的重要农艺指标,关系着作物的生育周期和产量。糖转运体作为植物重要的碳水化合物运输载体,作用于油菜开花时间的研究鲜有报道。本研究在油菜FOX-Hunting文库中鉴定了一个与油菜开花相关的蔗糖转运蛋白Bna.C02SWEET15,通过组织表达和亚细胞定位分析,转基因和突变体表型观察,开花关键基因表达水平检测等解析其生物学功能与调控机制。Bna.C02SWEET15在油菜各组织部位均能够表达,在花后30d种子中最显著。Bna.C02SWEET15定位于细胞膜,启动子活性主要在花药和花后30d种子中。在拟南芥中过表达Bna.C02SWEET15使植株开花提前,利于植株开花的光周期关键基因CO、FT、LFY表达明显上升,负调控基因FLC表达量降低。拟南芥突变体atsweet15a和RNAi-Bna.C02SWEET15转基因油菜均为晚花表型。推测Bna.C02SWEET15能够通过光周期途径正向调控油菜开花时间影响油菜的生育周期。研究结果对理解糖转运体在作物中的调控作用,为油菜高产育种提供了基因资源,奠定了理论基础。     

甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因的鉴定及功能性研究

液泡是调控植物细胞分化、生长发育的重要部位, AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因调控植物液泡内外离子平衡、离子运输以及能量供应。本研究利用功能已知的拟南芥AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因为参考序列在甘蓝型油菜全基因组数据库、NCBI植物基因组注释数据库等鉴定并筛选出9个BnaAVP1、3个BnaVHA-a2和4个BnaVHA-a3,并分析基因拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、蛋白二级结构及三维结构预测、高通量转录组测序等。发现甘蓝型油菜BnaAVP1和BnaVHA-a3的基因数量明显多于甘蓝和白菜;甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白属于由酸性氨基酸组成的稳定蛋白;系统进化选择能力的分析表明,甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3家族基因与甘蓝、白菜关系相近。转录组测序表明,低氮处理后,BnaAVP1s基因主要在地上部表达,且低氮3 h后地上部表达下调,低氮处理72 h根中表达量上调; BnaVHA-a2s和BnaVHA-a3s基因在地上部和根中均有表达, BnaVHA-a2s在低氮处理72 h后表达量基本呈上调趋势, BnaVHA-a3s在低氮3 h后基本呈下调趋势。低磷处理后,BnaAVP1s根中大部分基因表达上调,地上部表达基本无差异;BnaVHA-a2s表达基本无差异;BnaVHA-a3s地上部和根中均基本为上调趋势。该结果为进一步研究甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因生物学功能及AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白水解ATP提供能量供植物代谢的分子机制奠定基础,为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。     

AT-hook基因及其在植物开花调控中的研究进展

AT-hook基因是能够编码与双链DNA小沟中富含AT碱基的序列特异性结合的一类基因,其所编码的蛋白含有以甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(GRP)三个氨基酸残基为中心的DNA结合蛋白基序。笔者通过对AT-hook基因的特点和功能及其在拟南芥及水稻等高等植物开花中的调控作用综述。AT-hook基因不仅参与植物的生长发育及逆境胁迫与激素信号应答,同时在花器官的形成以及植物开花中也起着重要的调控作用。该基因在花器官组织中的表达量最高,影响成花素基因的表达,且其编码蛋白能够通过改变染色质状态或招募蛋白复合体在表观水平上调控植物开花相关基因的转录,从而影响植物开花。该基因可能为植物开花的表观遗传调控提供了新的途径。     

芸薹属物种(B.napus,B.rapa,B.oleracea)TCP基因家族全基因组鉴定和分析

TCP蛋白是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物叶发育、花对称性、侧枝发育等过程,具有重要的调控作用。为了揭示芸薹属TCP基因家族的功能和进化关系,本研究利用生物信息学方法对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的TCP转录因子家族成员、基因分类、基因结构、系统进化关系和结构域序列保守性进行分析。研究表明,白菜和甘蓝的TCP基因成员各有37条、甘蓝型油菜TCP基因成员有78条,且全部为亲水蛋白,大部分的TCP基因结构简单,不含内含子;序列分析表明,这些TCP基因均具有高度保守的TCP结构域;根据结构域差异和系统发育分析的结果,将白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TCP基因分为两类:ClassⅠ和ClassⅡ,ClassⅡ可继续分为CIN和CYC/TB1两个小组;聚类分析发现,芸薹属中白菜、甘蓝、甘蓝型油菜TCP基因与拟南芥垂直同源的At TCP11、At TCP16、At TCP23的TCP基因缺失,可能与芸薹属发生三倍化事件或驯化过程中的人工选择有关。以上研究将为揭示芸薹属TCP基因的功能提供重要的理论基础。     

甘蓝型油菜NCa细胞质雄性不育系统花药败育前期的基因差异表达

采用cDNA-AFLP技术研究了甘蓝型油菜NCa不育系、保持系和可育F1花药败育前期的基因差异表达谱。用224对引物对不育系、保持系及育性恢复F₁等3个材料的cDNA进行AFLP分析。回收、克隆可能与花药育性有关的差异条带,筛除假阳性,获得41条阳性差异条带（TDFs）;经测序、同源比对、功能预测,归并为35个非重复的TDFs。大多数TDFs在甘蓝型油菜中属首次报道。将已知功能的28个TDFs按其推测功能分为2大类10小类,82%的TDFs与细胞形态建成和降解、蛋白质合成、加工和转运、能量代谢、信号传导有关;基本涵盖花药发育相关的关键代谢过程。对其中7个TDFs基因进行了RT-PCR分析。结果表明,果胶甲酯酶基因和氨基酸通透酶基因都在不育系花蕾中大量表达,果胶甲酯酶基因在不育系叶片、保持系的花蕾、叶片中都没有检测到;而氨基酸通透酶基因有微量表达。驱动蛋白和乙醛脱氢酶主要在保持系花蕾中大量表达,而在不育系花蕾、叶片以及保持系叶片中都只有微量表达。玉米黄素环氧化酶（ZEP）和单脱氧抗坏血酸还原酶则在保持系花蕾、叶片和不育系叶片中大量表达,而在不育系花蕾中微量表达。花粉油体蛋白在不育系和保持系的花蕾中都有表达,不过保持系花蕾中的表达量约2倍于不育系花蕾;但是在两者的叶片组织中都没有检测到。本试验获得的差异表达基因对于了解油菜花药育性形成的调控机制提供了重要的分子信息。     

一个甘蓝型油菜细胞质雄性不育相关基因克隆和表达分析

利用甘蓝型油菜与播娘蒿融合杂种中的不育株与甘蓝型油菜杂交、回交，得到细胞质雄性不育系NJ65A。根据pol和nap雄性不育高度相关的基因orf224和orf222设计兼并引物，从NJ65A植株中克隆得到一个长度为675bp的基因，命名为orf224-NJ65A。该基因编码224个氨基酸，氨基酸序列与orf224、orf222和orf220序列相似性分别为：70％、53％、60％。RT—PCR表达分析表明：orf224-NJ65A在所检测的组织中都有表达，但在花、花蕾和茎中的表达量较大。推测orf224-NJ65A与细胞质雄性不育有关。     

甘蓝型油菜长链烷烃合成相关基因的克隆及其与BnCER1-2的互作

长链烷烃是甘蓝型油菜角质层蜡质的优势组分,在阻止植株的非气孔性水分散失中起主要作用。BnCER1-2催化甘蓝型油菜长链烷烃的生物合成,但BnCER1-2是否通过与其他蛋白互作调控长链烷烃合成还不清楚。前期通过甘蓝型油菜蜡质差异材料转录组筛选获得4个长链烷烃合成相关基因BnCER3.a10、BnCER3.c02、BnCYTB5B.c09、BnCER1-L2.a05。本研究克隆了这4个基因的编码序列,序列分析表明BnCER3.a10/c02和BnCER1-L2.a05前体蛋白具有典型的脂肪酸羟化酶与WAX2C末端结构域,而BnCYTB5B.c09具有Cyt＿B5蛋白家族保守结构域。亚细胞定位结果表明, BnCER3.a10/c02、BnCYTB5B.c09和BnCER1-L2.a05均定位于细胞内质网,与BnCER1-2共定位。双分子荧光互补(bimolecular fluorescent complementation,BiFC)与萤火素酶互补试验(luciferase complementation assay,LCA)检测结果表明, BnCER3.a10、BnCYTB5B.c09、B...     

甘蓝型油菜BnABCG8基因的克隆及表达分析

甘蓝型油菜是重要的油料作物之一,随着对油脂需求的日益增加,高含油量油菜育种有着很重要的现实意义。本研究克隆了甘蓝型油菜BnABCG8基因,全长1 722 bp,编码573个氨基酸。通过生物信息学分析,发现BnABCG8蛋白是一类典型的半分子ABC转运蛋白,具有"NBD-TMD"排列的结构域特点。系统进化分析表明,BnABCG8与拟南芥ABCG(WBC)亚家族亲缘关系较近。半定量PCR以及荧光定量PCR发现,BnABCG8基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花以及长角果等不同部位均有表达,在长角果中表达量最高,意味着BnABCG8极有可能参与脂质的运输调控植物的生长发育。     

甘蓝型油菜BnCNGC基因家族鉴定及其在核盘菌侵染和PEG处理下的表达特性分析

CNGC是植物中普遍存在的环核苷酸门控通道,对植物的逆境响应有重要作用。系统分析甘蓝型油菜BnCNGC基因家族成员全基因组分布、结构、进化及其响应不同逆境胁迫的表达特性,对于阐明其生物学功能具有重要意义。本研究利用拟南芥和甘蓝CNGC蛋白保守结构域及特异基序氨基酸序列在全基因组水平鉴定了甘蓝型油菜BnCNGC家族成员,分析其基因结构、染色体定位、蛋白理化性质、蛋白保守结构域、系统进化及启动子顺式作用元件等。利用转录组数据,筛选甘蓝型油菜逆境响应候选BnCNGC成员,并采用实时荧光定量PCR分析其在核盘菌、PEG模拟干旱胁迫下的表达模式。结果显示,共鉴定到49个甘蓝型油菜BnCNGC成员,分布于除A08、C06的17对染色体上,含有5～10个内含子,其上游1500 bp包含大量逆境胁迫响应元件。BnCNGC家族成员编码的蛋白质含413～801个氨基酸,相对分子量(MW)范围47.62～110.58kD,等电点(pI)范围6.10～9.88。系统进化分析表明,BnCNGC分为Group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四类。转录组数据分析表明, BnCNGC9、BnCNGC27和BnCNGC48均参与逆境胁...     

甘蓝型油菜铵转运蛋白基因家族成员的鉴定与表达分析

了解异源四倍体甘蓝型油菜中AMT基因家族的功能,为进一步克隆和利用基因改良甘蓝型油菜的氮素利用效率和铵毒抗性提供一定的理论基础。利用生物信息学的方法鉴定出20个BnaAMTs基因,其中14个为AMT1亚家族成员,6个为AMT2亚家族成员,它们不均匀地分布在油菜的12条染色体上。进化与保守基序分析结果表明,BnaAMTs蛋白亚家族内的蛋白质序列保守性较高,但亚家族之间的差异较大。BnaAMTs基因在油菜不同组织中的表达谱显示,该基因家族表达具有组织特异性。利用转录组测序结果分析发现,根部在供应高浓度的铵态氮和硝态氮时,BnaA7.AMT1;3表达量最高;在硝态氮缺乏条件下,BnaA5.AMT1;1表达量最高;在上述几种处理下,BnaC6.AMT1;1都是地上部表达量最高的拷贝。在缺硼或缺磷条件下,油菜BnaAMTs基因整体呈现表达上升的趋势;但在盐胁迫条件下,表达量下降;镉胁迫对BnaAMTs基因的表达影响较小。这些基因可能在铵态氮与其他必需营养元素的互作、镉胁迫、盐胁迫等逆境响应中发挥一定的作用;并为进一步深入解析甘蓝型油菜AMT家族基因的分子功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

甘蓝型油菜BES1转录因子家族的鉴定及比较基因组学分析

BES1转录因子家族对调节植物的生长发育和逆境胁迫具有非常重要的作用。本研究在甘蓝型油菜基因组测序完成的基础上,对芸薹属作物BES1转录因子家族的进化及表达进行了系统深入研究。本研究在甘蓝型油菜、白菜、甘蓝和拟南芥全基因组中分别鉴定到29条、15条、14条和8条BES1转录因子。通过系统发育、基因结构和保守基序的分析,这些转录因子被分为三组,即Group A、Group B和Group C。在甘蓝型油菜与白菜、甘蓝和拟南芥间分别鉴定出30对、32对和23对直系同源基因。甘蓝型油菜中含有15对旁系同源BES1基因,显著的高于其它3个物种。大多数BES1基因在根和叶中都具有较高的表达水平,表明这些基因在甘蓝型油菜生长发育过程中起到重要的作用。本研究对进一步探索该家族调控植物的生长及逆境适应的分子机制奠定了基础,同时为其它基因家族的研究提供了指导。     

菠萝AcMADS14的克隆及其在成花转变中的表达分析

MIKC型MADS-box家族成员SVP参与植物开花时间和花发育的调控。本研究从‘巴厘’菠萝中克隆到成花抑制蛋白SVP亚家族的一个同源基因AcMADS14,其开放阅读框长度为897 bp,编码299个氨基酸。序列分析发现AcMADS14蛋白包含1个高度保守的MADS-box结构域和1个半保守的K-box结构域。系统进化分析表明AcMADS14蛋白序列与油棕EgSVP和椰子CnSVP具有较高的同源性。通过RT-qPCR分析组织特异性发现AcMADS14在叶片、根等营养器官中表达较高,在花分生组织、雄蕊和雌蕊等生殖器官中表达量较低;外源喷施乙烯利抑制了AcMADS14在花芽分化阶段的表达,特别是在花器官分化期表达量显著下降。此外,转录激活活性分析表明Ac MADS14蛋白具有转录激活活性,可激活或抑制下游靶基因。综上,AcMADS14可能响应乙烯处理在菠萝营养生长转变为生殖生长的过程中发挥抑制作用,为探究菠萝成花分子机制提供了理论基础。     

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子At1g30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因At1g30210的全长读码框。多序列比对结果表明,在推导的氨基酸水平上,该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域,与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT-PCR实验结果表明,该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高,具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。