芒果HMGR家族基因的鉴定、系统进化和表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸(MVA)途径的第一个限速酶。为了探索HMGR家族基因在芒果中的作用,本研究鉴定了芒果HMGR家族基因,并对HMGR家族基因的理化性质、系统发育及在芒果中的表达量进行了分析。结果显示,芒果HMGR家族蛋白序列均包含完整的HMG-CoA_red结构域,且HMGR家族蛋白均为疏水性蛋白。系统发育树显示,HMGR家族基因是从苔藓植物开始形成的,且芒果HMGR家族基因均聚在双子叶植物的分支,与物种进化历程一致。HMGR家族基因在芒果品种‘贵妃’和‘台农’成熟果果肉中的表达量结果显示,Mi15g11840.1和Mi19g11720.1基因在‘贵妃’中的表达量显著高于‘台农’,Mi18g12500.1基因在‘贵妃’中的表达量显著低于‘台农’,而Mi04g11220.1基因在两个品种中的表达量差异不显著。本研究为进一步研究芒果HMGR家族基因在MVA途径中的作用提供了科学依据。     

芒果八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)影响类胡萝卜素的合成,是合成途径中关键基因。为了研究芒果果实中PDS基因的功能,本试验采用RACE方法从‘贵妃’芒果果实中克隆得到了一个八氢番茄红素脱氢酶(PDS),该基因全长c DNA序列为1 820 bp,开放阅读框为1 650 bp,编码549个氨基酸,分子重量为61.34 kD,等电点为6.78。聚类分析发现芒果PDS蛋白与柚子、香瓜和番木瓜等植物的亲缘关系较近。其氨基酸组成主要是丙氨酸(ALa),白氨酸(Leu),缬氨酸(Val)等。利用定量PCR技术对不同品种中的PDS基因表达量分析,发现红色‘贵妃’品种表达量最高,而绿色‘桂七’品种表达量最低,对其蛋白的结构域、三级结构及互作蛋白进行了预测,发现其含有Phytoene-desat、PLNO2487 superfamily等结构域。利用STRING数据库对其互作蛋白进行分析发现其与PSY、ZDS、CRTISO等蛋白可能有相互作用。本研究为进一步研究芒果果实类胡萝卜素生物合成的分子调控机理提供理论依据。     

不同品种芒果贮藏性状的比较及对热处理的反应

为解决芒果采后易软化、变黄和腐烂等问题,以‘台农’、‘红贵妃’和‘金煌’3个品种芒果为实验材料,分别进行热处理（50℃热水处理10 min）,并比较其作用效果。发现热处理能维持果实的硬度,但对糖、酸和Vc的含量无显著的影响,能抑制MDA的产生,但不能抑制芒果的细胞膜透性的增加。不同品种之间,从硬度和可滴定酸的保持以及低电导率、低MDA含量和较高SOD活性的保持,都充分说明了‘红贵妃’的耐贮性好于‘台农’和‘金煌’2个品种。     

木薯MeRSZ21a的克隆、生物信息学分析和表达模式分析

在非生物胁迫过程中,植物中SR蛋白(serine/arginine-rich proteins, SR)发挥着重要作用。本研究利用生物信息学分析方法,对木薯MeRSZ21a基因结构、理化性质、结构域、保守基序、系统进化等方面进行了分析,并分析MeRSZ21a在各组织中的表达,以及胁迫后其剪接模式和表达水平。我们之前的研究表明,木薯MeRSZ21a是SR蛋白家族中RSZ亚家族的成员之一。本研究结果表明MeRSZ21a基因全长为2 263 bp,编码160个氨基酸,蛋白大小为18 kD,属于亲水性碱基蛋白。MeRSZ21a含有RRM和zf-CCHC结构域,与野生大豆亲缘关系最近。在3个木薯品种‘W14’、‘Arg7’和‘Ku50’各组织中,MeRSZ21a在发育前期组织中表达量较低,在成熟的侧芽与叶组织器官中表达量较高。胁迫处理后,MeRSZ21a的转录本及表达量发生较大变化,其中叶片中转录本数均上升,并且对木薯进行不同温度(42℃,-3℃)胁迫处理后,根和叶中MeRSZ21a的表达水平显著性上调,表明在响应胁迫过程中,MeRSZ21a发挥着重要作用。这有助于进一步探索木薯MeRSZ21a在植物响应非生物胁迫中的功能。     

‘台农’、‘红芒’芒果果皮和果肉原花青素含量差异及其生物学活性评价

为了充分利用芒果资源,明确‘台农’、‘红贵妃’芒果果皮和果肉的原花青素含量及其抗氧化活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性,以成熟期‘台农’、‘红贵妃’芒果果皮和果肉为实验材料,用甲醇提取原花青素,盐酸-香草醛法测定其含量。通过羟自由基(·OH)、DPPH自由基、ABTS自由基清除率测定其抗氧化活性,Ellman法确定其乙酰胆碱酯酶抑制活性。结果表明:‘台农’和‘红贵妃’芒果果皮中原花青素含量差异显著,‘红贵妃’果皮原花青素显著高于‘台农’果皮原花青素。同一品种中,果皮原花青素含量显著高于果肉原花青素。‘台农’果皮和果肉中的原花青素对·OH、DPPH自由基和ABTS+·等自由基的清除能力很强,且显著高于‘红贵妃’果皮和果肉中原花青素的自由基清除能力。但是‘台农’、‘红贵妃’果皮和果肉中的原花青素对乙酰胆碱酯酶均具有很强的抑制活性。研究结果表明不同芒果品种原花青素含量差异显著,抗氧化能力也不同,但是均具有良好的乙酰胆碱酯酶抑制活性。本研究为进一步探讨不同品种芒果原花青素生物学活性及其作用机理奠定了基础。     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

芒果多胺氧化酶2(MiPAO2)基因克隆表达分析与沉默和过量表达载体的构建

本研究以芒果果皮为材料探究多胺(PAs)和多胺氧化酶2(PAO2)对芒果果实抗逆性的作用机理。多胺(PAs)如腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)是无处不在的聚阳离子,在不同的细胞代谢过程具有广泛的功能。多胺氧化酶2(polyamine oxidase 2,PAO2)是真核生物多胺分解代谢途径中的关键酶。本研究根据转录组测序得到芒果PAO2部分片段信息设计兼并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,分别在三个不同着色芒果品种(红色‘贵妃’品种,黄色‘金煌’品种,绿色‘桂七’品种)中进行PAO2基因全长cDNA序列的扩增,克隆得到了芒果果皮PAO2基因的全长cDNA序列命名为MiPAO2。结果发现三个着色品种cDNA序列只有几个碱基的差异,以红色‘贵妃’品种为例分析可得全长cDNA序列为1 542 bp,开放阅读框为1 209 bp,编码402个氨基酸,分子重量为43.93 kD,等电点为5.60,定位于过氧化物酶体。通过生物软件预测得到了三种三级蛋白结构图。对NCBI上刊载的30种不同植物构建系统发育树发现该基因编码的蛋白与枳的亲缘关系比其他植物物种的亲缘关系近。为深入探究MiPAO2基因在多胺分解代谢过程中的作用,本研究成功构建出MiPAO2-pTRV2基因沉默载体和MiPAO2-pGreen II 62-SK基因过量表达载体,为后续研究MiPAO2基因在芒果果实的抗盐、抗寒以及抗虫过程中的作用机理提供理论依据。     

菠萝AcMADS14的克隆及其在成花转变中的表达分析

MIKC型MADS-box家族成员SVP参与植物开花时间和花发育的调控。本研究从‘巴厘’菠萝中克隆到成花抑制蛋白SVP亚家族的一个同源基因AcMADS14,其开放阅读框长度为897 bp,编码299个氨基酸。序列分析发现AcMADS14蛋白包含1个高度保守的MADS-box结构域和1个半保守的K-box结构域。系统进化分析表明AcMADS14蛋白序列与油棕EgSVP和椰子CnSVP具有较高的同源性。通过RT-qPCR分析组织特异性发现AcMADS14在叶片、根等营养器官中表达较高,在花分生组织、雄蕊和雌蕊等生殖器官中表达量较低;外源喷施乙烯利抑制了AcMADS14在花芽分化阶段的表达,特别是在花器官分化期表达量显著下降。此外,转录激活活性分析表明Ac MADS14蛋白具有转录激活活性,可激活或抑制下游靶基因。综上,AcMADS14可能响应乙烯处理在菠萝营养生长转变为生殖生长的过程中发挥抑制作用,为探究菠萝成花分子机制提供了理论基础。     

芒果(Mangifera indica)RCCR基因的克隆及其基因沉默载体的构建

红色叶绿素降解产物还原酶(red chlorophyll catabolite reductase,RCCR)是叶绿素降解过程的关键酶,能将叶绿素降解过程中产生的红色叶绿素代谢物(Red chl catabolit)分解代谢为原初荧光叶绿素降解产物(Primary fluorescent chl catabolite)。本研究根据转录组测序得到RCCR部分片段信息设计简并引物,采取3'和5'cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,分别在三个不同着色芒果品种(红色‘贵妃’品种,黄色‘金煌’品种,绿色‘桂七’品种)中进行RCCR基因全长cDNA序列的扩增克隆得到了芒果果皮RCCR基因的全长cDNA序列。结果发现三个着色品种cDNA序列只有几个碱基的差异,以黄色金煌品种为例分析可得全长cDNA序列为1 134 bp,开放阅读框为975 bp,编码324个氨基酸,分子重量为36.21 k D,等电点为5.13。通过生物软件预测得到了三种三级蛋白结构图。对NCBI上刊载的30种不同植物构建系统发育树发现该基因编码的蛋白与橙子、克莱门柚等水果植物的亲缘关系比其他植物物种的亲缘关系近。近年来,病毒诱导的基因沉默(VIGS)是研究植物基因功能的有力工具,为深入探究RCCR基因在叶绿素降解中的作用,本研究成功构建出RCCR-pTRV2基因沉默载体,为后续研究RCCR基因在芒果果实成熟及果皮着色过程中的作用机理提供理论依据。     

‘GDDH13’和‘山定子’WRKY基因家族生物信息学比较及MdWRKY基因家族表达分析

WRKY基因家族是植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育和抵御逆境胁迫中发挥重要作用。‘山定子’是中国重要的野生苹果属抗性种质资源,抗寒能力强。本研究通过生物信息学方法,较全面的比较了‘山定子’和栽培苹果‘GDDH13’两份材料中的WRKY基因家族信息,结果显示:‘GDDH13’中WRKY基因数量比‘山定子’多7个,多出的7个WRKY基因分布在GroupⅠ和GroupⅢ两个亚组中;通过比较发现‘山定子’和‘GDDH13’中的WRKY结构域和基因结构在相近亚组内非常保守;发现‘山定子’的WRKY基因家族有更多的成员启动子区含有低温和干旱响应元件,这可能与‘山定子’抗逆性强有关;通过基因染色体位置和苹果基因组范围内对MdWRKY基因进行的同线分析表明串联重复和部分重复,可能在苹果WRKY基因家族的扩张和进化中发挥了重要的作用;通过器官特异性表达模式和果实发育过程表达分析,鉴定到MdWRKY64和MdWRKY67可能与苹果果实成熟密切相关;通过不定根发育过程的表达分析,筛选到8个MdWRKY基因可能参与苹果不定根的形成。本研究为苹果WRKY基因的进化提供了一些数据,并为苹果WRKY基因的功能鉴定提供了参考,进一步为苹果的分子育种提供了帮助。     

木薯EIL基因克隆和蛋白诱导表达及纯化

ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE(EIL)基因家族是乙烯信号通道重要的正调控因子,在乙烯信号传递过程中启动抗病相关基因表达参与植物免疫应答提高植物的抗性。为了研究EIL基因编码蛋白与下游靶基因特异性结合传递乙烯信号,是否参与木薯抗逆境胁迫的调控,本研究从木薯中克隆一个EIL同源基因,命名为MeEIL。分析MeEIL启动子所包含的各种功能元件,结果显示该启动子中含有G-box、W box和MYC等元件。对MeEIL基因的ORF分析结果表明该基因编码含621个氨基酸残基的蛋白质。使用同源重组的方法将MeEIL的CDS序列连接到蛋白表达载体pET32a上。SDS-PAGE检测表明在28℃和16℃都可成功诱导蛋白表达,且28℃诱导效果更佳,通过大量诱导蛋白表达并用His标签纯化试剂盒纯化,Western blot分析验证MeEIL蛋白被成功的诱导出来。     

芒果MiFTs基因家族克隆及其酵母双杂诱饵载体的构建

成花诱导是开花植物生长发育过程中最为重要的一环,而开花整合因子Flowering Locus T(FT)在这一过程中起非常重要的调控作用。目前,FT基因调控芒果成花的作用机制尚不清楚。本研究以‘四季蜜芒’为材料,克隆验证了从转录组测序数据中挖掘获得的3个FT同源基因,命名为MiFT1、MiFT2和MiFT3。生物信息学分析显示,3个MiFTs基因编码区长度分别为588 bp、540 bp和516 bp,分别编码氨基酸196个、180个和172个,分子量分别为48.97 kD、44.71 kD和42.27 kD,等电点分别为4.99、5.06和5.06,3个基因均含有一个保守的PEBP结构域。将MiFT1、MiFT2和MiFT3基因定向克隆到酵母表达载体pGBKT7上,通过菌落PCR和测序进行验证,并成功转化酵母菌株Y2H Gold感受态细胞。对诱饵质粒酵母菌进行自激活和毒性检测,发现pGBKT7-MiFT1、pGBKT7-MiFT2和pGBKT7-MiFT3在酵母菌种均不具备自激活性和毒性。此酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续蛋白互作筛选提供参考。     

水稻几丁质酶基因的转录与表达特征

几丁质酶与植物的生长发育、抗逆和防御反应相关。水稻PR3家族几丁质酶编码基因有19个成员,本文分析其转录特征,了解到有些基因属于组成型转录,有些基因属于组织特异型转录,分析了几丁质酶蛋白质的结构域,并对其进行了聚类和亚家族分类分析。利用免疫印迹技术分析了几丁质酶蛋白质的表达谱,发现CHIT5的表达量在水稻叶片生长过程中下调,而CHIT6、CHIT14、CHITC1和CHITC2的表达量上调。在水稻与白叶枯病菌(Xoo)的不亲和反应中,CHIT1、CHIT2、CHIT5、CHIT6、CHIT10、CHIT15和CHIT16的表达量上调,CHIT14、CHITC1和CHITC2的表达下调。进一步比较几丁质酶蛋白质在水稻-Xoo不同互作反应中的表达,发现其在亲和及不亲和反应中的表达模式类似,但一般在亲和反应中强度变化较大。此外,CHIT6蛋白质在对照反应中的表达量上调,提示CHIT6的表达受创伤的诱导。本文比较系统地揭示了水稻PR3家族几丁质酶编码基因的转录和蛋白质表达特征,为其功能解析提供了线索。     

白花泡桐纤维素合成酶PfCesA2及PfCesA8基因克隆及初步表达分析

为了获得白花泡桐纤维素生物合成途径关键酶基因-纤维素合成酶家族基因,本研究采用PCR技术和RACE技术,利用Oligo、Primer5等软件进行引物设计,从白花泡桐中克隆出纤维素合成酶基因两条,NCBI分析后,分别命名为PfCesA2(NCBI登录号:MK340935)及PfCesA8(NCBI登录号:MK340937)。PfCesA2基因的cDNA全长4164 bp,其开放阅读框(ORF)长度为3273 bp,能够编码含有1090个氨基酸的蛋白质,此蛋白质的相对分子质量为123431.95,等电点为6.70。PfCesA8基因的cDNA全长为3341 bp,其开放阅读框(ORF)长度为2955 bp,能够编码含有984个氨基酸的蛋白质,此蛋白质的相对分子质量为110241.71,等电点为6.20。二级结构分析表明二者都以α-螺旋和无规则卷曲为主。结构域和跨膜区分析表明二者在N端都含有锌指结构域,在C端都含有6个跨膜区,这些结构域能够表现纤维素合成酶的特征。系统进化树分析表明在所选取的物种当中,白花泡桐与芝麻、紫花风铃的亲缘关系较近。组织特异性分析结果表明,二者在茎中的表达量最高,根部次之,叶部最少;且在茎中,木质部的表达量高于韧皮部。说明二者可能主要参与次生壁的建成。本研究所克隆的两个基因属于白花泡桐纤维素合成酶家族基因,这在丰富该领域研究的同时,也能够为利用基因工程手段对泡桐木进行遗传改良提供重要的基因资源。     

毛竹GMD基因家族全基因组鉴定与表达分析

GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GDP-mannose 4,6-dehydratase, GMD)是生物体内参与多糖合成代谢的一个重要基因。本研究利用毛竹全基因组和转录组数据信息,对GMD基因家族进行细致分析,共鉴定出39个家族成员。毛竹GMD各家族基因的理化性质有一定差异,但所含甘露糖4,6脱水酶结构域进化相对保守。进化树分析将毛竹GMD基因家族分为3大类。该家族基因上游启动子序列存在多种光响应、环境胁迫、激素应答等有关顺式作用元件。同源模建显示毛竹GMD为同源二聚体蛋白质,两个亚基均有相同或催化功能。转录组数据分析发现,部分成员GMD基因在竹笋生长阶段基因高表达特征明显,表明其可能参与笋的生长发育。另外,GMD的表达受到不同激素的影响。本研究通过对GMD基因的生物信息学分析,有利于进一步明确毛竹GMD基因的功能及其在岩藻糖生物合成途径中的作用。     

向日葵PMADS2 LIKE基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因是调控花发育进程的关键转录因子。在向日葵中大量的花发育相关基因有待于发掘和鉴定。本研究以向日葵(Helianthus annuus)为材料克隆到了一个MADS-box新成员PMADS2 LIKE。序列分析结果显示该基因具有MADS-box家族典型的MIKC保守结构域;系统发育树分析发现该基因与拟南芥PI基因亲缘关系最近;q RT-PCR组织表达模式分析该基因仅在花和果实中表达,且在6个花器官中仅在雄蕊和花瓣表达;q RT-PCR定量分析表示该基因从开花前25 d一直表达到开花期,并且在开花前5 d表达量最高。研究结果表明,PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中具有一定的生物学功能。本研究的结果和推论为进一步探究向日葵PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中的生物学功能提供前期数据基础,为理清MADS-box基因在向日葵花发育中的调控网络提供线索。     

油菜超氧化物歧化酶基因家族生物信息学分析

超氧化物歧化酶(SOD)是重要的抗氧酶,在生物体内广泛存在。以油菜基因数据库为搜索平台,通过对油菜超氧化物歧化酶基因家族进行生物信息学分析。结果表明:油菜SOD基因家族主要含有32个基因,蛋白质的氨基酸序列长度86 aa^386 aa之间。BanSODs基因具有相对保守的结构,即包含SOD DNA结构域;HMA DNA结构域;Mn/N DNA结构域;Mn/C DNA结构域,SOD蛋白结构中含有7个α螺旋和4个β折叠结构域。进化树分析表明油菜SOD蛋白序列与谷子、小立碗藓蛋白序列具有相对较高的同源性。该研究结果可以为进一步了解油菜SOD基因家族和玉米抗氧化机制提供一定参考。     

豇豆(Vigna unguiculata)VQ蛋白家族基因的序列与进化分析

VQ蛋白是一类植物特有的转录调控辅助因子,主要与WRKY蛋白互作,参与诸多生物学功能。尽管一些植物VQ家族基因已经被鉴定,但在豇豆中有关VQ家族基因的研究未见报道。本研究利用生物信息学手段从豇豆中鉴定出37个VuVQ基因,并详细分析这些基因的序列、微共线性、表达谱与进化关系。染色体与共线性分析表明,豇豆VuVQ基因定位在11条染色体上,基因扩增主要由片段重复产生,其中4对重复基因所在区段共线性程度高。序列分析结果显示:豇豆VuVQ基因结构有3种类型,绝大多数无内含子;豇豆VQ蛋白均包含VQ结构域,同时这些VQ保守基序数目和顺序变异较高。进化研究揭示豇豆VQ蛋白存在6大类群,这些类群均起源于陆生植物。选择压力检测表示,豇豆的8对VuVQ基因均受严格的负选择。表达分析表明了豇豆VQ基因具有多样化的表达模式,这意味着VQ蛋白参与多种生物学过程。本研究结果为豇豆VQ基因的功能解析提供线索。     

谷子TCP基因家族成员序列特征及表达模式分析

为深入解析谷子TCP基因家族的功能,通过生物信息学方法对谷子TCP转录因子家族基因成员序列特征、基因结构、染色体定位、系统进化关系及表达模式进行分析。结果表明:除第8染色体之外,从谷子基因组上其余8条染色体中共鉴定出26个TCP家族成员,并根据其在染色体的顺序和位置先后进行命名,其中分布在第3和第5染色体上的TCP家族成员数量最多,高达5个。不同家族成员其编码的氨基酸残基数目具有明显差异,范围为95 aa^451 aa。其中SiTCP21基因编码氨基酸残基数目最少为95个氨基酸;而SiTCP15最多为451个氨基酸残基。26个TCP家族成员的蛋白结构中均含有bHLH保守结构域。基因表达分析结果表明,31%的成员在穗中的表达量明显高于其他组织,因此推测该基因家族可能对谷子穗部生长发育的调控起关键作用。本研究对深入研究Si TCPs家族基因的功能奠定了基础,也为谷子生长发育的调控机制提供了新的思路。