甘肃金鳟AFLP体系建立及应用

甘肃金鳟是我国自主培育的虹鳟新品种,为进行其种质资源研究和遗传管理,以其尾鳍为试验材料,提取基因组DNA,对影响甘肃金鳟扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,包括模板DNA浓度、基因组酶切时间、选择性扩增中Mg2+、预扩增产物稀释倍数及选扩性引物M+3/E+3配比等进行比较分析,建立了适于甘肃金鳟的AFLP反应体系。即：100 ng 基因组DNA,3 U EcoR I 37℃酶切3 h,再 Mse I 65℃酶切5 h;然后用1 U的T4连接酶连接12 h, 选扩25 μl PCR反应体系中Mg2+2.0 mmol/L,预扩产物稀释30倍,选扩引物M+3/E+3配比为8∶1,所得产物经电泳和银染后可获得清晰条带,效果良好;筛选出了适宜甘肃金鳟品种分析的13对选择性引物。     

羊耳蒜遗传多样性研究中AFLP反应体系的建立与初步应用

为研究羊耳蒜种质资源遗传多样性,建立并初步应用羊耳蒜AFLP反应体系。以羊耳蒜幼嫩叶片为材料,采用常规SDS法提取基因组DNA,通过优化AFLP反应体系中的几个关键因素,建立适合羊耳蒜的AFLP银染反应体系,并利用筛选出的引物组合对羊耳蒜的遗传多样性进行初步研究。经EcoRⅠ和MseⅠ酶组合37℃酶切3 h后可将500 ng基因组DNA完全切开;酶切产物和接头经16℃连接过夜后,用带有1个选择性碱基的预扩引物和带有3个选择性碱基的选扩引物分别进行扩增,扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染,能够得到清晰的扩增图谱。3对引物组合对8个羊耳蒜种群共185个体的扩增共得到221条条带,其中多态性条带195条,多态性条带百分率为88.24%。本研究结果表明建立的AFLP反应体系可用于羊耳蒜种质资源遗传多样性研究。     

大麻基因组DNA提取及AFLP体系的建立

本研究以大麻嫩叶为材料,以改进的SDS法,提取了高质量的大麻基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验条件的优化,建立了AFLP反应体系。研究结果表明:在常规的SDS提取液里加入8μL/mLβ-巯基乙醇(V/V)和3%PVP(M/V)能够提取到高质量的适用于AFLP的基因组DNA;选取150ng大麻基因组DNA来进行酶切,EcoRⅠ和MseⅠ各0.5U,在37℃酶切4h,即可完全酶切。最优的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0U Taq DNA polymerase、1.0μL25mmol/L Mg2+、0.4μL10mmol/LdNTPs、50ng/μL引物各1.0μL、4.0μL稀释50倍的预扩增产物及2μL10×PCR Buffer;使用该方法,获得了清晰、稳定的图谱并筛选到了18对多态性较好的AFLP引物组合。     

茄子及其近缘野生种AFLP分析体系的建立

本文以若干茄子自交系及其近缘野生种为材料,从DNA提取、酶切连接、预扩和选扩等几方面进行选择优化,建立起高效稳定的AFLP分析体系;从64对AFLP引物组合筛选出多态性好的引物组合38对,栽培种茄子和野生种托鲁巴姆间多态性高达68.5%.本实验室正以本AFLP分析体系开展茄子资源遗传多样性、青枯病抗性基因分子标记等遗传分析研究工作.     

菠菜AFLP反应体系初探

提取菠菜嫩叶DNA,运用改良CTAB法提取6份菠菜品种的DNA,对AFLP反应体系的DNA用量、酶切连接、预扩、选扩等试验条件进行了优化分析,初步建立适合于菠菜作物的AFLP反应体系.结果表明:①在PCR仪中酶切的效果比水浴的要好,酶切反应对酶切时间和DNA的浓度要求不敏感.②菠菜AFLP预扩选扩体系的反应体积为20 μL,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 1.6 μL,Taq-polymerase (5 U/μL) 0.2 μL最佳.为菠菜AFLP分子标记的品种亲缘关系鉴定和遗传育种等提供一定的理论基础.     

甘薯AFLP分子标记体系建立

AFLP是目前最常用的几种标记之一。本文以甘薯为材料,通过DNA提取、酶切、PCR扩增、凝胶电泳等系列程序摸索和优化,建立了甘薯的AFLP分子标记体系。优化的甘薯AFLP分子标记体系的程序如下:将4μl100ng/μl的甘薯DNA用EcoRⅠ酶、MseⅠ酶各5U进行双酶切,在37℃下酶切3h后再在65℃下酶切3h;然后加入10μl连接混合液在22℃下连接3h后在16℃下连接10h;取连接产物5μl,10μmol/LEcoRⅠ预扩引物和10μmol/LMseⅠ预扩引物各1.5μl,PCR缓冲液25μl,ddH2O17μl进行预扩增;取5μl稀释20倍后的预扩增产物,50ng/μlEcoRⅠ选扩引物和50ng/μlMseⅠ选扩引物各1μl,PCR缓冲液10μl,ddH2O3μl,进行选择性扩增。本研究为甘薯黑斑病和其他真菌性病害的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。     

芒属植物AFLP分析体系的建立与优化

对AFLP实验流程中的基因组提取、酶切等关键因素进行优化,建立了芒属植物的AFLP(扩增片段长度多态性)分析体系。本研究分别采用常规CTAB法和改良的CTAB法提取芒属植物基因组DNA,基因组分别用HindⅢ/MseⅠ系统和PstⅠ/MseⅠ系统进行酶切和连接一步反应,连接产物稀释20倍后进行预扩增,预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增。结果显示:采用改良CTAB法提取的DNA质量优于常规CTAB法;采用PstⅠ/MseⅠ系统酶切的DNA多态性高于HindⅢ/MseⅠ系统。采用优化后的AFLP体系分析30份供试芒属植物材料,从64对引物中筛选出8对多态性较好的AFLP选择性扩增引物,多态性比率达到100%,表明优化后的AFLP体系适合于芒属植物的分子标记分析,为芒属植物种质遗传多样性的分子研究奠定了技术基础。     

小麦锈菌AFLP分子标记技术体系的建立

以小麦条锈菌、杆锈菌、叶锈菌的夏孢子为材料,通过DNA提取、酶切、PCR扩增、凝胶电泳等系列程序摸索和优化,建立了锈菌的AFLP分子标记体系如下： 40μl酶切体系中采用了EcoRI、TrulI各5U,37℃3h,65℃3h双酶切4μl 100ng/μl的DNA; 然后加入10μl连接混合液22℃连接3h,16℃10h; 连接产物5μl,10μMEcoRI、10μMTru1I预扩引物各1.5μl,PCR反应液25μl,ddH2O 17μl进行预扩;预扩产物稀释20倍后取5μl,50ng/μl EcoRI、Tru1I选扩引物各1μl,PCR反应液10μl,ddH2O 3μl体系进行选择性扩增,为小麦锈病和其他真菌性病害的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。     

葎草DNA的提取及AFLP标记反应体系的建立

本文对CTAB法、改良CTAB法和SDS法提取雌雄异株植物葎草(Humulus scandens L.)基因组的方法进行了比较分析,并在此基础上对影响葎草AFLP扩增的关键因素模板浓度、酶切时间、选择性扩增模板浓度进行了优化.结果表明,改良的CTAB法更适合葎草基因组DNA的提取;同时利用AFLP分子标记技术,采用EcoI-Mse I酶切组合,共筛选27对引物组合,确定了适用于葎草AFLP反应的最佳酶切连接、预扩和选扩体系.同时发现2对引物组合E-ACG M-CTA和E-AAC M-CAC共扩增出5条雌雄性别特异条带.     

马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选

本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。     

甘蓝品种的AFLP指纹鉴别图谱分析

本试验采用AFLP技术分析了来自全国9个栽培地区的44个甘蓝主栽品种,共筛选了40对E 3/M 3引物组合,多态性条带的数量从0条到15条不等。其中引物组合E-AAC/M-CTA是甘蓝品种中多态性最高的引物,有15条多态性条带,多态性条带的百分率为30%,但该引物不足以区分44个供试的甘蓝品种。同时筛选了11组E 2/M 3对引物组合,其中引物组合E-AG/M-CTC产生了13条清晰的多态性条带。以E-AAC/M-CTA和E-AG/M-CTC这两对引物组合的多态性条带构建了44份甘蓝品种材料的指纹图谱,此指纹图谱可以将供试的44份材料一一区分。     

萝卜抽薹性研究的AFLP体系建立与优化

摘要：本研究以萝卜‘春雪总太’为优化材料,对AFLP体系的酶切时间,相关酶、Mg2+、dNTPs的用量,模板稀释倍数以及扩增循环数等6个重要影响因素进行摸索和优化,建立了适合萝卜抽薹紧密连锁基因研究的AFLP分子标记体系。结果表明：在20μL酶切体系中,将400ng的样品DNA用各0.2μLEcoR I和MseI 37℃双酶切10min, 65℃灭活10min;向 5μL酶切产物中加入EcoR I接头和MseI接头各0.5μL,用0.5μL的T4连接酶在20μL的体系中22℃连接过夜;向5μL稀释5倍后的连接产物中加入预扩引物各0.6μL,Mg2+1μL,dNTPs1.5μL,Taq酶0.2μL,ddH2O补齐至15μL,预扩增35个循环;取5μL稀释20倍后的预扩增产物,其他成分用量同预扩增相同,用ddH2O补齐至15μL进行选择性扩增。并将此优化体系在秋白、秋青、春白、秋红、水萝卜五种生态型的16份萝卜材料上进行了验证,电泳条带清楚,多态性强。     

十字花科蔬菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. Campestris）AFLP分析体系的建立及优化

以英国华威大学收集的十字花科蔬菜黑腐病菌野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris）的6个生理小种菌株为材料,优化了该类菌种的AFLP分析体系包括DNA的提取、Mse I/EcoR I酶切时间、扩增反应体系的组成及染色方法等步骤,建立了一套适于该菌种的AFLP分析体系。该体系中各最优因素为：酶切体系为50 μL,模板DNA用量为600 ng,酶切体系中Mse I和EcoR I各加入5 U,酶切温度为37℃,反应时间为4~6 h;预扩增产物稀释10倍进行选择性扩增;检测方法为银染法,银染液中硝酸银含量为8 g/L且染色时间是15 min时效果最佳,该体系的建立为该类菌种的分子水平遗传多样性研究提供了技术支撑。     

天门冬AFLP反应体系的建立及优化

为探讨天门冬种质间遗传多样性奠定基础,采用单因子试验,建立并优化了天门冬AFLP反应体系,研究酶的用量、酶切时间、预扩增体系和选择性扩增等对PCR扩增的影响。酶切反应体系加入5.0 U EcoR I和Mse I于37℃保温3 h;连接反应体系加入1.0 U T4-DNA连接酶、2.0 pmol Mse I接头和2.0 pmol EcoR I接头,16℃保温过夜;选择性扩增反应体系加入1.0 U Taq DNA聚合酶,0.4 μL EcoR I和Mse I选择性引物;并筛选得到了8对清晰、多态性高的AFLP引物。17份天门冬种质对建立的AFLP反应体系检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬种质多样性的分析。     

甘蔗AFLP分析技术体系的建立

研究目的】为了建立甘蔗AFLP标记技术体系;【方法】本文通过对甘蔗抗、感黑穗病的杂交亲本CP84-1198和科5,以及根据其杂交后代的浸渍接种田间抗性鉴定结果所构建的抗、感黑穗病池的AFLP银染法分析;【结果】建立了甘蔗黑穗病抗性的AFLP分析实验体系,同时将AFLP-银染技术应用于甘蔗近缘植物斑茅抗旱胁迫及其对照材料的cDNA差别筛选,建立了一种mRNA差别显示技术体系。实验过程中还筛选出了四对能在抗、感亲本上扩增出特异条带的引物,以及一对在斑茅水分胁迫和对照中表现良好差异的引物,为下一步的实验工作的开展奠定了基础。【结论】通过本实验建立了甘蔗AFLP分析技术体系、变性聚丙烯酰胺凝胶的快速银染、凝胶简单保存以及聚丙烯酰胺凝胶中的特异条带的高效回收技术。     

Comparing RAPD and AFLPTM analysis in discrimination and estimation of genetic similarities among apple (Malus domestica Borkh.) cultivars

Forty-one apple (Malus × domestica Borkh.) cultivars were screened for RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) and AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) markers. RAPD analysis was performed with 35 arbitrary 10-mer primers, selected from 60 primers tested (kits A, C and E, Operon Technologies, Inc.). Of a total of 362bands observed, 208 (57.5%) were polymorphic. Three-hundred-and-eighty-one AFLP fragments were obtained with 8primer combinations, of which 218 (57.2%) were polymorphic. Cultivars differentiated through mutation were included in this study and showed identical patterns when analysed with both RAPD and AFLP analysis. The estimated genetic relationships were correlated (r = 73.7%) between the analysis with the two different markers. UPGMA analysis was performed and dendrograms were constructed using either the data apart from each(RAPD and AFLP) method or combined in a single joint matrix. The relationships among the forty-one studied cultivars were basically consistent with the known lineage and geographic origins of the cultivars. The four Portuguese cultivars included in this study clustered together and diverged from the other cultivars. Apparently they constitute an independent genetic pool, which could be of interest for apple plant breeders. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

Inter and intra-species Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) variations in the genus Cicer

Intra and inter-species ISSR variation and use of ISSR markers in determination of genetic relationship were investigated in an accession collection representing twoperennial and six annual Cicerspecies. Screening of Ciceraccessions with SSR primers revealed highly reproducible amplicon profiles with relatively high multiplex ratios. Many of the primers generated amplicon profiles with which not only the differences among species can readily be identified, but also polymorphisms within species could be detected more efficiently. PCR products at 150 gel positions detected using six SSR primers in Cicer accessions were treated as dominant DNA markers and utilized to compute the distances among accessions and species. Cluster analysis of accessions and species revealed groupings that corroborate our previous studies of relationships based on allozyme and AFLP analysis. Consistent with the AFLP analysis carried out in the same accession collection, ISSR-based groupings indicated that perennial C. incisumis genetically close to the annuals of the second crossability group (C. pinnatifidum,C. bijugum, C. judaicum) while C. reticulatum is the closest wild species to the cultivated chickpea. ISSR-based variation estimates were relatively higher when compared to previous estimates computed from RAPD and AFLP data. Technically, ISSR analysis combines the PCR-based targeting of microsatellite-associated polymorphisms with no prior sequence requirement and stringent PCR conditions. Similarly, when compared to AFLP analysis, it is less technically demanding allowing to survey polymorphic loci in the genome. Thus, ISSR-PCR technology is a reliable, fast, and cost-effective marker system that can be used to study genetic variation and genetic relationships in the genusCicer. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.